Las plantas en condiciones naturales interactúan con una gran variedad de microorganismos. Por lo anterior, la planta debe ser capaz de distinguir entre potenciales simbiontes y patógenos. Quizá una de las interacciones planta-microorganismo más interesante es la que se lleva a cabo entre leguminosas y bacterias fijadoras de nitrógeno. Esta simbiosis se caracteriza por un alto grado de especificidad , la cual es controlada a través del intercambio de señales moleculares entre leguminosas y rhizobios compatibles. Como resultado de esta comunicación molecular es la formación del nódulo, en el cual los rhizobios fijan el nitrógeno atmosférico y lo incorporan al metabolismo de la leguminosa. Además de esta alta especificidad, los rhizobios deben de ser capaces de evadir la respuesta inmune de la leguminosa hospedera y de esta forma establecer la simbiosis. Diversas evidencias experimentales indican que los rhizobios usan mecanismos similares a los que usan los microorganismos patógenos para evadir la respuesta inmune. Uno de estos mecanismos usados por los patógenos es la regulación de la actividad de proteínas Argonautas, las cuales forman parte del complejo de silenciamiento de RNAs mensajeros mediado por RNAs pequeños no codificantes. Aunque existen evidencias que demuestran que los rhizobios son capaces de modular la respuesta inmune en la interacción simbiótica con leguminosas, aún no se han descrito detalladamente los procesos genéticos y moleculares que lo controlan. Asimismo, a pesar de que los rhiziobios usan mecanismos similares a los que emplean microorganismos patógenos para la inhibición de la respuesta inmune, hasta el momento no se ha reportado que los rhizobios lo lleven a cabo a través de la regulación de la actividad de proteínas Argonautas. Resultados preliminares obtenidos en nuestro laboratorio, indican que plantas de soya (Glycine max) que sobreexpresan el gen que codifica para la proteína Argonauta 5 (AGO5) muestran una reducción en su respuesta inmune. Asimismo, hemos observado que AGO5 incrementa su expresión más de 10 veces en raíces inoculadas con Bradyrhizobium japonicum (B. japonicum). Estos resultados preliminares nos permiten sugerir un posible papel de AGO5 en la regulación de la respuesta inmune durante la simbiosis entre leguminosas y rhizobios. En la presente propuesta, mediante enfoques de genética reversa, secuenciación masiva de RNAs mensajeros y RNAs pequeño no codificantes, así como de bioinformática, se pretende determinar el papel que juega AGO5 en la modulación de la respuesta inmune durante la simbiosis entre soya y Bradyrhizobium japonicum. Con estos experimentos se pretende determinar el nivel en el que AGO5 regula la respuesta inmune de soya. Asimismo, se pretende determinar si AGO5 juega un papel en el establecimiento de una simbiosis exitosa que se traduzca en la formación de nódulos activos. Finalmente, con la combinación de secuenciación masiva y análisis bioinformáticos, pretendemos identificar que RNAs pequeños no codificantes están asociados a AGO5 durante la simbiosis de soya y B. japonicum. Además identificaremos los genes que son regulados por los RNAs pequeños no codificantes. Asimismo, con los datos obtenidos en esta propuesta se propondrá un modelo mediante el cual AGO5 regula la simbiosis entre leguminosas y rhizobios Objetivo General Determinar el papel de la proteína Argonauta 5 en la regulación de la respuesta inmune durante la interacción simbiótica entre leguminosas y rhizobios Objetivos particulares 1) Analizar la expresión de AGO5 en eventos tempranos de la interacción leguminosa-rhizobio 2) Identificar la localización subcelular y expresión espacial de AGO5 mediante fusiones transcripcionales y traduccionales, respectivamente. 3) Silenciar la expresión de AGO5 en raíces transgénicas de soya (Glycine max) 4) Determinar si la disminución de la expresión de AGO5 afecta respuestas características de la respuesta inmune inducida por MAMPs. 5) Determinar si AGO5 tienen un efecto en la tasa de nodulación 6) Inmunoprecipitar AGO5 para identificar los RNAs pequeños no codificantes asociados a ella durante la simbiosis entre leguminosas y rhizobios. 7) Identificar los genes blanco de los RNAs pequeños identificados en el objetivo específico 6. Resultados Esperados Durante la ejecución de la presente propuesta se espera obtener los siguientes resultados 1) Determinación del perfil de expresión y localización de AGO5 durante la simbiosis entre soya y Bradyrhizobium japonicum 2) Identificación de los aspectos de la respuesta inmune que controla AGO5 3) Demostrar si AGO5 es necesario para una simbiosis exitosa entre soya y Bradyrhizobium japonicum. 4) Identificación de los RNAs pequeños no codificantes que estén participando en la regulación de la respuesta inmune durante la simbiosis entre soya y Bradyrhizobium japonicum. 5) Establecimiento de un modelo mediante el cual AGO5 regula la simbiosis entre leguminosas y rhizobios. 6) Presentar nuestro resultados en congresos internacionales 7) Publicación de al menos dos artículos científicos en revistas internacionales de prestigio. 8) Se planea formar dos licenciados en Biología y al menos un Doctor en ciencias.

Puesto que la disminución de la respuesta inmune en los eventos permite establecer asociaciones simbióticas entre leguminosas y rhizobios, es importante entender los mecanismos genéticos/molecular que controlan este proceso. Conocer y entender estos procesos permitirán diseñar estrategias para hacer eficiente la fijación biológica del nitrógeno en leguminosas de interés comerciales, tales como frijol y soya. Es ampliamente documentado que el uso excesivo de fertilizantes de nitrógeno ha conllevado a la contaminación de suelos y mantos freáticos. En años recientes se ha puesto interés en hacer posible que plantas no leguminosas (e.g. maíz y arroz) pueden interaccionar con bacterias fijadoras de nitrógeno, esto con la finalidad de reducir la dependencia de fertilizantes sintéticos. Estudios recientes han demostrado que, con excepción de las plantas de las familias de las Brassica, la mayoría de las plantas cuentan con los genes necesarios para establecer asociaciones simbióticas con bacterias fijadoras de nitrógeno (Delaux et al., 2014). Se ha propuesto que en la interacción no-leguminosa y rhizobios la respuesta inmune no se disminuye durante esta interacción. Por lo que entender como la respuesta inmune es disminuida en la interacción leguminosa-rhizobio permitirá contribuir a desarrollar estrategias experimentales que permitan lograr la interacción entre plantas no leguminosas y rhizobios, y disminuir la necesidad de fertilizantes sintéticos.