En el laboratorio estamos interesados en entender el papel del K+ en la estructura y función de la piruvato cinasa (PK). Utilizando como modelo de estudio principalmente las PKs de músculo de conejo, de Thermofilum pendens y Vibrio cholerae. En este proyecto estamos interesados en estudiar las tres PKs que posee V. cholerae. Es de nuestro interés entender por qué esta bacteria posee tres enzimas para llevar a cabo la misma función. Para llevar a cabo el estudio primero se caracterizaran las proteínas sobreexpresadas y después construiremos mutantes de deleción de cada una de las PKs en V. cholerae; con lo que pretendemos entender para qué necesita V. cholerae tres enzimas que llevan a cabo la misma reacción enzimática. Por otra parte se correlacionarán los resultados con la expresión de los diferentes genes en la bacteria en presencia de diversos requerimientos energéticos. Con estos antecedentes es relevante mencionar que el proyecto se va a dividir en dos etapas. En la primera etapa, se pretende obtener la clonación, expresión, purificación y caracterización del gen pykA-2 que contienen la información para dar PK independientes de K+. Es importante mencionar que ya contamos con los genes pykA-1 (PK independiente) y pyk-F (PK dependiente), así como con las proteínas purificadas y en proceso de caracterización. En la segunda etapa se pretende obtener la deleción de cada uno de los tres genes que codifican para la PK y su expresión en la bacteria en distintas condiciones. Para las mutantes de deleción de cada uno de los genes de V. cholerae se realizarán curvas de crecimiento de la bacteria en diferentes condiciones como son: aerobiosis y anaerobiosis; así como en presencia de diferentes fuentes de carbono de la glucólisis y de la cadena respiratoria. Cabe mencionar que ya contamos con algunos resultados preliminares: Tenemos dos proteínas purificadas y en proceso de caracterización, una independiente (PKVC I) y otra dependiente (PKVC II) de K+. Los resultados muestran enzimas con características muy diferentes entre sí. La tipo I (PKVC I) es dependiente de catión monovalente y la mayor activación se obtiene en presencia de K+ seguida de NH4+, Rb+ y Cs+, selectividad que coincide con lo reportado para las PKs dependientes. La tipo II (PKVC II) muestra actividad independiente de catión monovalente. Por otro lado, la PK tipo I utiliza como efector alostérico positivo a la fructosa 1,6 bisfos y no se activa por ribosa 5-P ni por AMP. La PK tipo II en ausencia de efector alostérico (ribosa 5-P o glucosa 6-P) no muestra saturación por PEP, por lo que no se pudieron calcular los parámetros cinéticos para este substrato y esto sugiere que la enzima tiene muy poca afinidad por el PEP. El hecho de que estas dos enzimas muestren propiedades diferentes entre sí, como es el caso de la activación por K+ y que respondan a efectores provenientes de distintas vías metabólicas nos puede estar sugiriendo que la PK juega papeles muy importantes durante el metabolismo de la bacteria en distintas etapas de la vida y en condiciones ambientales diversas.

La piruvato cinasa es una enzima que participa en la glucólisis, se encuentra presente en todos los organismos y se ha estudiado por muchos años. No obstante, a la fecha no es claro cual es el mecanismo a través del cual el catión monovalente la activa. A pesar de haber cientos de enzimas que se activan por catión monovalente, la piruvato cinasa utiliza al K+ como activador esencial aumentando su actividad hasta 10,000 veces. Sin embargo hay otra familia de piruvato cinasas que son independientes de K+. En la mayoría de los organismos, sólo se encuentra presente un tipo de piruvato cinasa: dependiente o independiente de catión monovalente. No obstante, existen algunas alfa-proteobacterias que presentan enzimas tanto dependientes como independientes. A este grupo pertenece Vibrio cholerae, bacteria que posee dos genes (pykA-1 y pykA-2) que codifican para enzimas independientes y un gen (pykF) que codifica para enzima dependiente de catión. Hasta la fecha no se sabe si los tres genes son funcionales, aunque sus secuencias presenten marco de lectura abierto con todas sus secuencias consenso presentes. No obstante, no existe ningún estudio reportado de alguna de las piruvato cinasas de V. cholera, y tampoco hay reportes de otros organismos en los que se encuentren presente tres piruvato cinasas. La idea de este proyecto es caracterizar los tres diferentes genes de la piruvato cinasa de V. cholerae y entender por qué esta bacteria posee tres enzimas para llevar a cabo la misma función. Así como construir mutantes de deleción de cada uno de los genes en V. cholerae y tratar de entender el papel que juega cada una de las tres enzimas en la bacteria. También, pretendemos correlacionar nuestros resultados con la expresión de los diferentes genes involucrados en las vías metabólicas que utiliza V. cholerae para mantener sus requerimientos energéticos.