El virus de la inmunodeficiencia adquirida humana tipo 1 (VIH-1) infecta principalmente a células del sistema inmune (linfocitos T y monocitos/macrófagos) y es capaz de provocar la fusión de las células infectadas con células no infectadas, conduciendo a la formación de células multinucleadas. La presencia en la sangre de virus que tienen la capacidad de inducir fusión de linfocitos T in vitro, se asocia con la progresión a SIDA de los individuos infectados. Estudios previos de nuestro laboratorio muestran que la fusión celular inducida por proteínas del VIH-1 da lugar a una población heterogénea de células fusionadas que difieren en composición celular, las cuales, por consiguiente, constituyen una fuente de variabilidad funcional. El presente proyecto se propone el estudio de las implicaciones de la fusión celular para la funcionalidad inmunológica y la replicación viral. El enfoque experimental se basará en el análisis de las células fusionadas y las células circundantes no fusionadas por citometría de flujo, microscopía de fluorescencia y PCR cuantitativo. Se utilizarán cepas prototipo del VIH (conocidas como cepas de laboratorio) para infectar e inducir la fusión de líneas de células T y monocitos, así como de células de la sangre periférica de donadores sanos. Específicamente, los estudios se enfocarán en: A) El efecto de la fusión de células T CD4+ sobre la replicación viral. Se determinará la replicación del virus en experimentos de fusión de células infectadas con células blanco reporteras, las cuales contienen el gene de la proteína verde fluorescente (GFP) acoplado a las secuencias promotoras del VIH-1. Se determinará también la expresión intracelular del antígeno viral p24, así como la viabilidad celular. B) El efecto de la activación mediada por CD3 y CD28 sobre la fusión de linfocitos T CD4+ y su relación con la expresión de moléculas de superficie implicadas en la función linfocitaria. Linfocitos de la sangre periférica se estimularán con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 acoplados a perlas magnéticas y posteriormente serán cocultivadas con células transfectadas que expresan las proteínas de la envoltura viral. C) Fusión monocito-linfocito inducida por el virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1: características funcionales y replicación viral. Nuestras observaciones han mostrado que líneas celulares transfectadas que expresan las proteínas de la envoltura del VIH-1, son capaces de fusionarse con monocitos, formando heterocariones, los cuales muestran un predominio del fenotipo mieloide y un marcado cambio morfológico. En este proyecto se determinará si la fusión puede actuar como un estímulo de activación y diferenciación para los monocitos. Los resultados de estas investigaciones contribuirán al conocimiento del papel de la fusión celular en el mantenimiento y/o control de la infección por el VIH-1 y en la función del sistema inmune. El proyecto tendrá una duración de 2 años y contará con la colaboración de investigadores del departamento de Inmunología del Instituto de Investigaciones Biomédicas de la UNAM. En el proyecto participará un estudiante de doctorado y se contempla la incorporación de dos estudiantes mas (licenciatura y posgrado).

A) Sobre el efecto de la fusión de células T CD4+ sobre la replicación viral. En el últimos año hemos implementado el cultivo de cepas prototipo del VIH-1 (cepas IIIB y MN) en la linea celular H9 para su propagación. Asimismo, hemos optimizado los protocolos experimentales para la infección de las líneas linfocíticas reporteras CEM-GFP, JLTR y Rev-CEM (37). Estas células contienen el gene de la proteína verde fluorescente (GFP) acoplado a las secuencias promotoras del VIH-1 (LTR), de modo que la infección induce una señal fluorescencia verde que puede ser cuantificada por citometría de flujo. El uso de las células reporteras permitirá determinar la infectividad de los sobredantes obtenidos durante la propagación de los virus. Asimismo, se realizarán experimentos de fusión de células reporteras infectadas con células no infectadas, con el propósito de determinar el nivel de replicación viral en las células fusionadas por medio de la señal fluorescente verde. B) Sobre el efecto de la activación mediada por CD3 y CD28 sobre la fusión de linfocitos T CD4+. En estudios preliminares observamos que la activación mediada por las moléculas CD3 y CD28 favorece marcadamente la fusión de linfocitos T CD4+ de la sangre periférica con células Env+. La activación va acompañada de un aumento de la expresión de CD4, además de un aumento de la expresión de moléculas de adhesión (35). Durante el desarrollo del presente proyecto se llevarán a cabo experimentos adicionales para confirmar estos resultados. De ser así, estas observaciones implicarían que la activación del sistema inmune puede potenciar la fusión de células infectadas con células no infectadas, con efectos sobre la función inmunológica y la replicación viral. C) Sobre la fusión monocito-linfocito inducida por el VIH-1. Hemos reportado que las células Env+ son capaces de fusionarse con células de la línea monocítica THP-1. La fusión causa una marcada reducción en la expresión de marcadores linfoides (CD3 y CD28) en las células fusionadas, mientras que los marcadores mieloides se conservan a niveles normales (CD32 y CD68) (31). Asimismo. observamos que al igual que los monocitos no fusionados, los heterocariones son capaces de fagocitar eritrocitos opzonisados. Adicionalmente, los heterocariones mostraron un cambio morfológico que recuerda el aspecto de monocitos activados (36). Durante este proyecto se pretende ahondar en la caracterización fenotípica de los heterocariones, analizando la expresión de marcadores de activación en comparación con monocitos no fusionados expuestos a activadores clásicos. Estos estudios serán necesarios para determinar si la fusión inducida por las proteínas del VIH-1 puede actuar como un estímulo de diferenciación para los monocitos. Las investigaciones descritas aquí contribuirán al conocimiento del papel de la fusión celular en el mantenimiento y/o control de la infección por el VIH-1 y en la función del sistema inmune. Los resultados serán publicados en revistas especializadas indizadas y constituirán las tesis de los estudiates participantes. Los estudiantes obtendrán capacitación teórica y técnica avanzada en virología e inmunología. Asimismo, se fomentará su aprendizaje y el intercambio de ideas mediante su participación en actividades académicas como congresos, cursos y seminarios.