Los fármacos basados en proteínas recombinantes son los de mayor crecimiento. Un subgrupo de ellos son los ensamblajes proteicos multiméricos, los que están constituidos por una o varias proteínas que se autoensamblan en macroestructuras, incluyendo icosaedros, nanotubos, láminas, espirales, etc. Los ensamblajes proteicos multiméricos tienen aplicación como vacunas, vectores para terapia génica y sistemas de entrega de medicamentos. Una de las modificaciones químicas más importantes que sufren las proteínas durante su producción y almacenamiento es la oxidación. Esta modificación ha sido estudiada extensamente en proteínas, pero no en ensamblajes proteicos multiméricos. Además de los efectos que tiene la oxidación en las proteínas mono o diméricas, como son la pérdida de su estructura, función y agregación, los efectos en los ensamblajes proteicos multiméricos pueden incluir desensamblaje, exposición de epítopos no deseables, etc. En este proyecto se evaluará el efecto de la oxidación en ensamblajes proteicos multiméricos utilizando como modelo VP6 de rotavirus expresada en el sistema células de insecto-baculovirus. VP6 es una proteína polimórfica. En este trabajo se estudiará VP6 desensamblada y ensamblada en nanotubos. Debido a la complejidad analítica de la caracterización del efecto de la oxidación en ensamblajes proteicos multiméricos, se iniciará el trabajo con el estudio in vitro de la oxidación de VP6. Se utilizarán como agentes oxidantes el peróxido de hidrógeno y el radical oxidrilo. Se utilizarán varios métodos para evaluar el ensamblaje de la proteína, medir el daño oxidante e identificar los sitios de daño. En paralelo, se diseñará un sensor para medir el ambiente oxidante en cultivos de células de insecto en biorreactores controlados y con monitoreo del redox. Se propone que ese sensor esté constituido por baculovirus que contendrán en su superficie policisteínas, las que formarán cistinas cuando estén expuestas a la oxidación. Utilizando las metodologías desarrolladas durante los estudios in vitro, se seguirá la oxidación de VP6 primero durante el proceso de purificación por cromatografía y durante su almacenamiento por un año, vida de anaquel mínima necesaria para una vacuna en el mercado. Durante el segundo año, se seguirá la oxidación que sufre VP6 durante su producción en biorreactores, utilizando el sensor ya descrito. Los resultados obtenidos se utilizarán para diseñar estrategias de producción de ensamblajes proteicos multiméricos que minimicen la oxidación de la proteína, aumentando la calidad del biofármaco. La realización de este proyecto resultará en 2 tesis de doctorado, una de maestría, una de licenciatura y la formación de un becario posdoctoral. Además, se espera publicar al menos 3 artículos en revistas internacionales arbitradas indexadas. Este estudio forma parte de un proyecto más amplio en el grupo, en donde se evalúa el uso de VP6 como vacuna.

Las proteínas recombinantes se han consolidado como la opción terapéutica y profiláctica más efectiva. El mayor incremento en el número de medicamentos aprobados para uso humano se ha dado en esta clase de moléculas. Sin embargo, la complejidad de las proteínas recombinantes sobre los medicamentos químicos requiere una caracterización más extensa, así como un mayor entendimiento de las alteraciones químicas o físicas de las proteínas que pueden disminuir su efectividad o resultar en efectos adversos. La complejidad de los medicamentos basados en ensamblajes proteicos multiméricos es aún mayor, pues no sólo es necesario caracterizar a las proteínas que forman el multímero, sino que el multímero per se debe ser extensamente caracterizado. Entre las aplicaciones médico farmacéuticas de los ensamblajes proteicos multiméricos están las vacunas y los vectores para terapia génica. Actualmente están en el mercado vacunas contra hepatitis B y virus del papiloma humano constituidas por ensamblajes proteicos multiméricos. _x000D_ _x000D_ Una de las modificaciones químicas de las proteínas más relevantes es la oxidación. La oxidación provoca pérdida de función y cambio de estructura de las proteínas. Estos cambios pueden no sólo disminuir la eficacia del biomedicamento, sino que también pueden resultar en reacciones inmunes indeseables con efectos en el paciente a largo plazo. A pesar de la importancia de la oxidación, sólo hemos encontrado un reporte sobre el efecto de la oxidación en ensamblajes proteicos multiméricos del antígeno de superficie del virus de la hepatitis B (HBsAg) (Tleugabulova et al., 1999)., quienes reportan que la oxidación produce agregación._x000D_ _x000D_ En este proyecto se realizarán las siguientes contribuciones:_x000D_ 1. Un proceso de producción de ensamblajes proteicos multiméricos que permita obtener material de alta calidad con potencial uso como vacuna. _x000D_ 2. Un becario posdoctoral, dos alumnos de doctorado, uno de maestría y una de licenciatura con conocimientos de frontera sobre la producción de proteínas recombinantes con uso médico farmacéutico, así como ensamblajes proteicos multiméricos._x000D_ 3. Incremento del conocimiento en el país para la producción de productos biotecnológicos de última generación._x000D_ 4. Metodologías que permitan cuantificar los efectos de la oxidación sobre los ensamblajes proteicos multiméricos, con el fin de estudiar este fenómeno de forma cuantitativa._x000D_ 5. Conocimiento sobre los oxidantes y las cinéticas de oxidación in vitro de los ensamblajes proteicos multiméricos y su comparación con las de proteínas monoméricas._x000D_ 6. Conocimiento sobre la capacidad de ensamblaje de las proteínas oxidadas, así como la identificación del daño que evita el ensamblaje._x000D_ 7. Conocimiento sobre el daño oxidante que sufren los ensamblajes proteicos multiméricos durante su purificación y estrategias para evitar el daño._x000D_ 8. Evaluación del daño oxidante que sufren las ensamblajes proteicos multiméricos durante su almacenamiento._x000D_ 9. Contar con un sensor que permita evaluar el estrés oxidante que las proteínas sufren durante su producción en el sistema células de insecto-baculovirus._x000D_ 10. Conocer el daño que los ensamblajes proteicos multiméricos sufren durante su producción y conocer si ese daño es relevante al compararlo con los experimentos in vitro._x000D_