SÍNTESIS DEL PROYECTO _x000D_ _x000D_ Trypanosoma cruzi es un protozoario hemoflaglelado causante de la enfermedad de Chagas. Este parásito es transmitido a sus huéspedes vertebrados por un insecto hematófago. En ambos huéspedes el protozoario completa un ciclo de vida complejo que alterna formas replicativas y formas diferenciadas no replicativas. El estadio celular más accesible para su estudio en el laboratorio es el de epimastigote (forma proliferativa de T. cruzi presente en el insecto vector) ya que crece en suspensión en medios axénicos. En la fase estacionaria de cultivos de epimastigotes se presentan condiciones que estimulan, aunque con poca eficiencia, la diferenciación a tripomastigotes metacíclicos no proliferativos. La eficiencia in vitro de este proceso puede incrementarse con medios pobres en nutrientes donde la mayoría de las células del cultivo (superior a 80%) son células diferenciadas._x000D_ _x000D_ Interesados en biología fundamental de T. cruzi, particularmente a la biogénesis de ribosomas, nuestro laboratorio ha dedicado más de 20 años de trabajo al estudio de las moléculas ribosomales de este organismo. Los genes de RNA ribosomal (RNAr) se transcriben mayoritariamente en las formas replicativas del parásito bajo el control de un promotor bien estructurado. Datos recientes no publicados de nuestro grupo de investigación sobre el análisis sistemático de la presencia de nucléolos en epimastigotes de fase exponencial y en proceso de diferenciación, indican que la estructuración de nucléolos de tipo esférico y fácilmente reconocibles no parece ser una condición necesaria para que las células se dividan y se diferencién a tripomastigotes metacíclicos. Con la intención de monitorear la función nucleolar (síntesis, procesamiento y ensamblaje de ribosomas nacientes) en mejores condiciones que la ultraestructura nucleolar, hemos elegido a fibrilarina como un marcador molecular. Es ampliamente reconocido que esta proteína es una molécula conservada en la evolución que desempeña funciones nucleolares clave en la maduración del RNAr precursor como lo son su procesamiento y modificación. _x000D_ _x000D_ Del genoma (diploide) secuenciado en T. cruzi se encuentran anotados dos pares alélicos codificadores de proteínas homólogas a fibrilarina. Los pares alélicos son similares entre sí pero claramente reconocibles unos de otros (60% de similitud). El objetivo del presente proyecto es caracterizar comparativamente la expresión de los pares alélicos codificadores de fibrilarina durante el crecimiento de epimastigotes de T. cruzi y su diferenciación a tripomastigotes metacíclicos. En este análisis se contempla la caracterización de RNA mensajeros en términos de su abundancia relativa durante el crecimiento exponencial de epimastigotes en cultivo, la fase estacionaria- y la diferenciación a tripomastigotes metacíclicos. Versiones recombinantes de fibrilarina acoplada con la proteína verde fluorescente o con alguna etiqueta molecular de epitopes particulares (como el de la hemaglutinina) serán transfectadas en T. cruzi. Esto permitirá estudiar la distribución de la proteína en líneas transgénicas homogéneas (i.e., poblaciones clonadas) que expresen versiones alelo-específicas identificables. Mutantes de remplazo serán construídas (selección de recombinación homóloga) y caracterizadas. _x000D_ _x000D_ Del proyecto se espera el avance en la comprensión de un evento biológico fundamental, la biogénesis de ribosomas. Por ser la célula de estudio un patógeno importante se espera contribuir a mejores condiciones conceptuales para enfrentarlo._x000D_

CONTRIBUCIÓN_x000D_ _x000D_ En el nucleolo de células eucariontes se transcribe y ensambla el RNAr de ribosomas citoplásmicos. Representa, en masa, el sitio de mayor actividad transcripcional nuclear ya que el RNAr es por lo menos 80% del RNA total celular. Desde bacterias hasta vertebrados la síntesis de ribosomas está ligada a proliferación celular. Los famosos nucleolos hipertróficos de células tumorales ejemplifican esta situación. Los protozoarios son eucariontes unicelulares que divergieron tempranamente del linaje de células nucleadas. No en todos ellos se aprecian nucleolos bien definidos, y no se ha demostrado la necesidad de que en estas especies el nucleoplasma requiera estructurar nucleolos definidos para la expresión de genes ribosomales de RNA. Datos recientes de nuestro laboratorio indican que células cultivadas in vitro de Trypanosoma cruzi no requieren, como una condición esencial estructurar nucléolos de tipo esférico para proliferar y diferenciarse a tripomastigotes metacíclicos. Con intenciones de estudiar el funcionamiento nucleolar en mejores condiciones, este proyecto propone analizar la expresión de fibrilarina en T. cruzi como un marcador nuclear. Dado el conocimiento generado en sistemas eucariónticos modelo, como son las levaduras (entre otros) se sabe que fibrilarina es una proteína esencial con funciones clave en el procesamiento y modificación de RNAr durante la maduración y ensamblaje de ribosomas nacientes. Su estudio en T. cruzi contribuirá a la eventual comprensión de los eventos moleculares fundamentales para la biogénesis de ribosomas citoplásmicos en este patógeno importante. Huelga decir que el conocimiento básico de T. cruzi aportará mejores condiciones conceptuales para enfrentar un problema de salud aún sin solución, la enfermedad de Chagas._x000D_ _x000D_ _x000D_