Se ignoran aspectos relacionados con el control de las señales iniciadas por las auxinas que determinan el curso de diferenciación de raíces adventicias, aunque se sabe que los niveles de auxina libre regulan este proceso. Existen diferentes mecanismos capaces de controlar estos niveles en una porción de tejido y en un momento determinados: la tasa de síntesis, el transporte, la conjugación de la auxina libre con azúcares, aminoácidos o proteínas y el catabolismo. El proyecto se centra en este último. El catabolismo comprende la oxidación de auxinas y la única evidencia de actividad enzimática comprometida en esta transformación es la correspondiente a ácido indolacético oxidasa (AIAox) que presentan algunas peroxidasas de clase III in vitro. El trabajo se propone evaluar en cada isoenzima con actividad peroxidasa presente en fracciones del apoplasto de tallos de brotes axilares de Solanum lycopersicon, su capacidad para oxidar AIA y AIB, en presencia y ausencia de peróxido de hidrógeno. De existir isoenzimas que oxiden auxinas, se estudiará si se encuentran solubles en el apoplasto o si están asociadas a la pared celular, y si su asociación se debe a interacciones iónicas o covalentes. Se examinará si los cambios en el pH en el apolasto influyen en la actividad contenida en la fracción soluble e insoluble del apolasto, buscando entender si la acidificación del apolasto que promueve inicialmente la administración de auxinas puede controlar, en ciertas condiciones, la actividad auxina-oxidasa. Se estudiará si los brotes axilares sometidos a enraizamiento presentan alguna variación en las isoenzimas con actividad peroxidasa/auxina-oxidasa comparando las fracciones obtenidas los días cero, uno, tres, cinco y diez. Se compararán dos procedimientos de extracción: el primero consistirá en recoger la porción soluble del apoplasto y homogeneizar el resto del tejido en buffer de baja fuerza iónica para mantener las proteínas originalmente unidas a la pared celular y reducir al máximo la contaminación con proteínas de localización intracelular, el segundo implicará digerir con celulasa y pectinasa, cuidando que no exista ruptura celular, para sedimentar los protoplastos y disponer así de una fracción soluble que contenga las proteínas del apoplasto. Se evaluará la contaminación con proteínas intracelulares usando proteínas marcadoras. Se tratarán las paredes celulares con soluciones cuya fuerza iónica y pH varíen, evaluando si hay cambios en la actividad peroxidasa/auxina oxidasa en las fracciones solubles resultantes. La actividad peroxidasa se evaluará con diamofluoreno, bencidina y o-dianisidina; la actividad auxina oxidasa se evaluará revelando los geles con azul rápido BB base y en solución, con el reactivo de Salkowski, por oximetría y evaluando la auxina residual en diferentes tiempos de incubación mediante HPLC con un detector de arreglo de diodos. Se realizarán corridas en dos dimensiones, de las fracciones enriquecidas de peroxidasas del apolasto para disponer de muestras cuyo grado de pureza permita estudiar su secuencia de aminoácidos. Con base en esta secuencia, se construirán oligonucleótidos para amplificar fragmentos de los transcritos correspondientes, que serán empleados como sondas para determinar la presencia de mensajeros en los diferentes tiempos definidos en el curso del enraizamiento, para explorar la posibilidad de evaluar mediante hibridación in situ, la expresión de los genes que codifican para estas peroxidasas. Se evaluarán diferentes agentes y pruebas histoquímicas para aproximarse a conocer la localización específica de las isoperoxidasas en el apoplasto.

La diferenciación celular está controlada por gradientes de sustancias entre las cuáles destacan las hormonas. El entendimiento de la diferenciación celular permite regenerar individuos a partir de porciones de tejidos, que constituyen clones, éstos tienen un interés económico importante, porque permiten la preservación de genotipos seleccionados; el jitomate (Lycopersicon esculentum) es una planta de gran importancia en este contexto, además de ser una de las plantas que se eligió para estudiar su genoma, y en consecuencia, están disponibles los datos de sus genes. En las plantas, las auxinas son hormonas especialmente importantes en el control de la diferenciación, aunque el mecanismo es pobremente entendido (Li S-Xue et al, 2007). Existen diferentes vías por la que se controlan las concentraciones de auxinas activas, una de ellas, la degradación oxidativa, se conoce muy poco y a la fecha, no se ha demostrado que ocurra con la participación de alguna enzima in vivo, aunque si se dispone de evidencia de la actividad oxidasa in vitro sobre el ácido indolacético (AIA) que tienen algunas peroxidasas, en ausencia de peróxido de hidrógeno (Gazarian et al, 1998; Chaoui et al, 2004; Johri et al, 2005). El presente estudio pretende evaluar la actividad oxidasa y peroxidasa de aquellas isoperoxidasas de clase III que se mantengan asociadas a la pared celular después de fraccionarlas empleando soluciones de baja fuerza iónica y las que se encuentren en la fracción soluble del apoplasto, evaluando la proporción en la que la acidificación del medio disocia cada isoenzima con actividad d auxina oxidasa, pretendiendo con ello aportar elementos que lleven a explicar uno de los mecanismos que controlan los niveles endógenos de estos reguladores del crecimiento. Dado el elevado número de peroxidasas de clase III en las plantas, es posible que se expresen diferentes isoenzimas y en diferente grado en el curso del enraizamiento adventicio, y dado que el jitomate enraiza con facilidad en el transcurso de 10-12 días, es ventajoso trabajar con esta especie, por la facilidad de desarrollar experimentos en suficiente número para garantizar la reproducibilidad de los resultados, y finalmente, en esta especie se ha reportado que ninguna de sus isoperoxidasas es capaz de oxidar al AIA en ausencia de peróxido, situación de excepción que en este trabajo podrá ponerse a prueba. También podrá examinarse la localización subcelular y la capacidad de estas enzimas para oxidar Acido Indol Butírico (AIB), que se desconoce en buena medida y aún cuando los niveles de expresión sean tan bajos que imposibiliten revelar la actividad, el aislamiento y amplificación de ARNs mensajeros es una vía al alcance para evaluar el control sobre su expresión.