SINTESIS DEL PROYECTO_x000D_ El epitelio intestinal está sujeto a una continua renovación a expensas de células troncales madres durante toda la vida del organismo. Su homeostasis está basada en el balance preciso entre proliferación, diferenciación y apoptosis; la pérdida del control de este balance lleva al desarrollo de cáncer. Los tumores de tipo colo-rectal, se encuentran entre las formas de neoplasias humanas más frecuentes. Diversos estudios han demostrado que en la mayoría de los casos de este tipo de cáncer se presentan alteraciones en la vía de señalización denominada Wnt. Por otro lado, en múltiples sistemas se ha descrito la participación de la proteína cinasa C (PKC) en procesos de carcinogénesis. _x000D_ En nuestro laboratorio hemos encontrado que existen cambios de expresión en proteínas de la ruta Wnt así como en las distintas isoformas de PKC entre el estado normal (no maligno) y el estado maligno de líneas celulares de colon humano. Mediante estudios de co-inmunoprecipitación recíproca e inmunofluorescencia, demostramos la interacción específica de las proteínas clave de la ruta Wnt con isoformas de PKC. Nuestros resultados mostraron con claridad que mientras que la inhibición farmacológica o la disminución de la expresión de PKCζ bloquean de manera dependiente de la dosis la activación de la ruta Wnt canónica, la proliferación celular y la expresión del gen blanco de ruta Wnt c-myc, la inhibición de la actividad o la disminución de la expresión de PKCδ producen el efecto opuesto. En conjunto, nuestros datos han mostrado que PKCζ modula positivamente la ruta Wnt canónica mientras que PKCδ la modula negativamente y por tanto, que PKC juega un papel importante en la regulación de la vía Wnt. Sin embargo, desconocemos el mecanismo molecular por el cual PKCζ y PKCδ ejercen estas acciones en la ruta Wnt, y, dado que demostramos que se requiere de su actividad catalítica, queremos saber cuáles proteínas de la ruta Wnt son sustrato de estas isoformas de PKC. Por tanto, el objetivo general del presente proyecto es caracterizar el mecanismo molecular por el cual participan varias isoformas de PKC en la ruta de señalización Wnt canónica, es decir, dependiente de β-catenina. Sin embargo, en este proyecto queremos estudiar también el papel que juega la PKC en la ruta Wnt no canónica, independiente de β-catenina, en la que se ha mostrado que PKC es un efector, pero no se ha estudiado en el intestino. _x000D_ Todos los procesos de fosforilación mediados por proteínas cinasas son revertidos por proteínas fosfatasas. Se ha reportado que en el caso de la ruta Wnt, la proteína fosfatasa 2A participa tanto a nivel del complejo de degradación de β-catenina como a nivel de la proteína Dishevelled, controlando su estado de fosforilación y por tanto, su activación. Interesantemente, es bien conocido en múltiples sistemas celulares que las acciones de la PKC son revertidas por PP2A. En nuestro laboratorio hemos encontrado que en todas las muestras de colon normal que hemos analizado (líneas celulares humanas en cultivo y biopsias de pacientes), se expresan las dos isoformas de la subunidad A de la proteína fosfatasa 2A (α y β). Interesantemente, y en contraste, en las muestras de pacientes con carcinoma de colon, así como en las líneas celulares malignas de colon analizadas, sólo aparece la expresión de una de las dos isoformas de la subunidad A. Estos datos sugieren que la pérdida de la expresión de una de las isoformas de esta subunidad, podría ser utilizada como marcador de malignidad del epitelio intestinal. Además, hemos encontrado que esta subunidad A de PP2A que se expresa en células malignas, interacciona de manera específica con β-catenina, sugiriendo que puede modular la ruta de señalización Wnt. En este proyecto examinaremos entonces también cómo participa PP2A en la regulación de la ruta Wnt._x000D_ Finalmente, como la ruta Wnt es esencial para mantener la capacidad de autorenovación de células troncales, y ya hemos podido aislar y cultivar a las células troncales de cáncer de colon, utilizaremos como material biológico no sólo a líneas celulares de carcinoma de colon humano en cultivo, sino también a las células troncales obtenidas a partir de estas líneas._x000D_

CONTRIBUCIÓN E IMPACTO DEL PROYECTO_x000D_ _x000D_ El cáncer de colon ocupa el tercer lugar de causas de muerte por cáncer en México y en países industrializados como los de América del Norte. La familia de PKC representa actualmente un reto interesante para el desarrollo de agentes terapéuticos más efectivos contra el cáncer. A pesar de que algunos inhibidores y oligonucleótidos dirigidos contra isoformas de PKC se han utilizado desde hace tiempo en la práctica clínica (fase II), los resultados no han sido muy alentadores. A este respecto, además de que hay mucho por aprender, la co-expresión de varias isoformas en el mismo tejido, con modos de regulación diferentes que pueden actuar antagonísticamente, así como el uso de inhibidores relativamente específicos de isoforma, son probablemente las causas principales de las fallas obtenidas. Con este proyecto se pretende profundizar en el conocimiento de los mecanismos de regulación de la ruta Wnt por fosforilación/desfosforilación mediada por isoformas de PKC y por PP2A, respectivamente. Dado que se ha descrito que estas vías participan de modo determinante en el desarrollo de neoplasias colo-rectales, el discernir los puntos de convergencia en su señalización y cómo se regulan, llevarían al diseño de fármacos específicos para el tratamiento de este padecimiento. Además, si las células troncales cancerosas tienen la habilidad exclusiva de regenerar tumores, el conocer los mecanismos moleculares implicados en el control de su fenotipo permitiría diseñar estrategias terapéuticas más selectivas y efectivas para combatir el cáncer de colon._x000D_ _x000D_ Como se mencionó en los antecedentes, hemos encontrado que en las células tumorales tanto de biopsias de pacientes como de líneas tumorales de colon, sólo se observa la expresión de una de las dos isoformas de la subunidad A de la proteína fosfatasa 2A en vez de dos encontradas en colon normal. Estos datos sugieren que la pérdida de la expresión de una de las isoformas podría ser utilizada como marcador de malignidad. Es bien conocido que los procesos inflamatorios crónicos del tracto intestinal (síndrome de Cusi, síndrome de Chron, etc.) constituyen un factor de riesgo para desarrollar cáncer de colon. Por tanto, los resultados de nuestro estudio serían de gran utilidad para el diagnóstico precoz de malignidad, cuando dejan de expresar una de las dos isoformas de la subunidad A, para poder proporcionarles a estos pacientes un tratamiento eficaz temprano._x000D_