Los rotavirus del grupo A causan diarrea en humanos y varias especies de animales, pertenecen a la familia Reoviridae, y tienen un genoma de 11 segmentos de RNA de cadena doble (RNAcd). En células susceptibles los viriones infectantes funcionan como una máquina que transcribe el RNAcd para producir simultáneamente los 11 RNAm virales, con rendimientos inversamente proporcionales a la longitud de cada transcrito, lo que significa que no hay regulación de la expresión génica a nivel transcripcional. Se sabe que dos proteínas de rotavirus participan en regulación post-transcripcional, la proteína no estructural 3 (NSP3) y la proteína estructural 2 (VP2). NSP3 es dimérica y se une al factor de iniciación de la traducción eIF4G en el mismo sitio reconocido por la proteína de unión a poli-A (PABP), por lo que se piensa que desactiva el efecto estimulatorio de PABP sobre la traducción de RNAm poliadenilados. NSP3 también se une al extremo 3’ UGACC de los RNAm virales, por lo que se ha propuesto que podría estimular su traducción por un mecanismo similar al de PABP sobre RNAm celulares. Sin embargo esta hipótesis no ha podido ser comprobada, ya que al abatir la expresión de NSP3 con RNA interferente no se reduce la traducción de los RNAm virales. Experimentalmente NSP3 es un poderoso inhibidor de la traducción celular, sin embargo no entendemos porqué en células infectadas con rotavirus se afectan los siguientes componentes de la maquinaria de traducción: i) NSP3 se une simultáneamente con eIF4G y Roxan, una proteína citoplásmica-nuclear de función desconocida, y no es claro si esto tiene que ver con inhibición de la traducción celular o con alguna otra función; ii) se fosforila eIF2alfa, lo que constituye otro mecanismo de inhibición de la traducción; iii) no se producen gránulos de estrés, cúmulos de complejos de traducción estancados que normalmente se producen si eIF2alfa se fosforila; y iv) se relocaliza PABP al núcleo. Por otro lado, VP2 constituye la capa proteica interna de geometría icosahédrica del virión, la cuál interacciona directamente con la RNA polimerasa y el genoma viral. Interesantemente VP2 tiene un efecto antagónico al de NSP3, ya que recientemente encontramos que VP2 expresada en un sistema del virus vaccinia estimula la traducción de RNAm celulares en forma global. Nuestro objetivo es estudiar los mecanismos de regulación de la expresión génica de rotavirus en los que participan NSP3 y VP2. Para este fin determinaremos el efecto de la expresión de NSP3 y/o VP2, así como de diversas delesiones y mutaciones de éstas proteínas, en un sistema expresión del virus vaccinia en células de mamífero, en ausencia de otros componentes virales. Determinaremos en forma integral los diversos efectos conocidos de éstas proteínas, en particular en los siguientes aspectos: i) la traducción de RNAm celulares; ii) la traducción de RNAm virales transfectados; iii) la ubicación de RNAm virales transfectados en gránulos de estrés; iv) la localización intracelular de Roxan y PABP. A través de estudiar el efecto funcional de delesiones y mutaciones de NSP3 y VP2, se pondrá a prueba el conocimiento actual sobre los dominios funcionales y aminoácidos importantes para la función inhibitoria de la traducción de NSP3 y para la estimulación de la traducción que causa VP2, contribuyendo a entender los mecanismos regulatorios de la expresión génica de rotavirus a nivel post-transcripcional.

En estudios previos demostramos que la proteína NSP3 es un potente regulador traduccional que abate la traducción de RNAm celulares poliadenilados, y que este efecto depende del dominio de unión a eIF4G y del status dimérico de la proteína (Padilla-Noriega, et al., 2002). Resultados recientes nos obligan a replantear cúal es el mecanismo por el que NSP3 abate la traducción celular, y si esta proteína estimula o no la traducción viral. En este sentido hay nuevos participantes que potencialemente tiene un papel relevante en los mecanismos bajo estudio, como son VP2, Roxan, PABP, y los gránulos de estrés. En el presente estudio abordaremos estas preguntas determinado en forma sistemática los efectos conocidos de NSP3 y VP2, expresando en forma individual o combinada estas proteínas, así como mutantes derivadas de éstas en sus dominios funcionales conocidos: unión a RNA de ambas proteínas, así como los de dimerización-unión a Roxan y de unión a eIF4G de NSP3. Se estudiará el efecto de las proteínas NSP3 y VP2 solas o combinadas, así como el de sus mutaciones en: i) la traducción de RNAm celulares; ii) la traducción de RNAm virales transfectados; iii) la ubicación de RNAm virales transfectados en gránulos de estrés; iv) la localización intracelular de Roxan y PABP. Así contribuiremos a conocer los mecanismos de inhibición de la traducción de NSP3 y de estimulación de la traducción de VP2. Las mayores contribuciones al conocimiento del mecanismo de traducción se han generado a partir de enfoques bioquímicos y genéticos. Los modelos virales han sido fundamentales para conocer aspectos tan relevantes de la traducción como: i) la existencia de sitios internos de iniciación de traducción que confieren independencia del cap, que fueron primero identificados en poliovirus (Pelletier, y Sonenberg, 1988); ii) la relevancia del dominio amino de eIF4G para la traducción dependiente del casquete 5’ del RNAm (cap), el cuál es cortado por la proteasa 2A de poliovirus (Anonymous, 2000), iii) la enorme relevancia de la fosforilación de eIF2alfa por la cinasa PKR como mecanismo inhibitorio de la traducción en general, ya que un gran número de virus han desarrollado contramedidas para inactivar a PKR por todos los mecanismos imaginables (Anonymous, 2000). Los rotavirus por carecer de cola de poli-A en el extremo 3’ constituyen un modelo ideal para estudiar la relevancia de esta característica biológica fundamental de organismos eucariontes. El estudio de los mecanismos que inactivan la traducción de RNAm con cola de poli-A, así como los mecanismos que permiten la expresión de los RNAm virales sin poli-A, como los de rotavirus, son entonces relevantes en el contexto de la biología de rotavirus y de organismos eucariontes en general.