El pulque es una bebida fermentada alcohólica tradicional mexicana no destilada, considerada desde nuestra perspectiva como un ambiente naturalmente enriquecido en el que se presentan tres tipos de fermentación que definen sus características sensoriales: (1) Fermentación alcohólica, desarrollada principalmente por diversas especies de levaduras y la bacteria Zymomonas mobilis, siendo el principal producto el etanol; (2) Fermentación ácida, desarrollada por bacterias ácido lácticas y ácido acéticas, en donde se genera como principal producto de su actividad ácido láctico y ácido acético y (3) Una fermentación viscosa, desarrollada principalmente por bacterias ácido lácticas del género Leuconostoc mesenteroides productoras de exopolisacáridos extracelulares. En nuestro grupo de trabajo (Dr. Francisco Bolívar- Guillermo Gosset, IBT-UNAM), venimos desarrollando una línea de investigación enfocada al análisis de la diversidad bacteriana y genética presente en muestras de diversos ambientes, entre ellos el pulque, con la finalidad de identificar y aislar genes y microorganismos de interés en los procesos metabólicos identificados en esta bebida, para incorporarlos en diferentes proyectos de ingeniería de vías metabólicas relacionados con la producción de diferentes metabolitos de interés biotecnológico (Gosset, 2005; Escalante et al., 2009). En este contexto, los estudios realizados por nuestro grupo han permitido identificar la diversidad bacteriana presente en tres muestras de pulque de diferente origen geográfico (Morelos, Hidalgo y Estado de México), por métodos no dependientes del cultivo microbiano (Escalante et al., 2004), detectándose la presencia de grupos bacterianos no reportados previamente para esta bebida, de grupos bacterianos comunes independientemente del origen de la muestra y de grupos específicos para cada muestra. Se caracterizó y reportó también por primera vez, la dinámica de la diversidad bacteriana durante una fermentación del pulque de la localidad de Huitzilac, Morelos, por medio de un enfoque polifásico que incluyó el análisis de la diversidad bacteriana cultivable y no cultivable, perfil fisicoquímico de la fermentación, análisis por microscopía electrónica de barrido durante la fermentación y análisis reológico (Escalante et al., 2008). Los resultados de este último trabajo permitieron identificar también a bacterias no reportadas previamente en el pulque, demostrándose la presencia de una gran diversidad de bacterias lácticas durante la fermentación. Con base en estos antecedentes, iniciamos un estudio cuyo principal objetivo es el de aislar nuevos microorganismos, principalmente bacterias lácticas, con la capacidad de producir EPS no reportados previamente y así como la búsqueda de nuevas cepas bacterias lácticas con capacidad probiótica. Los resultados preliminares de esta aproximación han permitido: (1) Aislar dos EPS denominados como EPSA y EPSB de tipo glucana producidos por aislados identificados como Leuconostoc citreum. La caracterización inicial del EPSB por resonancia magnética nuclear (RMN) permitió detectar un alto grado de ramificación, comparado con otras dextranas (glucanas) producidas por cepas de L. mesenteroides (Dols et al., 1998; Quirasco et al., 1999; Conca, 2008). La amplificación por PCR amplificado la región que codifica el motivo conservado del dominio catalítico de las enzimas involucradas en la síntesis de ambos EPS (Kralj et al., 2003), su secuenciación y análisis en la base de datos no redundante del NCBI permitió observar que uno de estos genes amplificados (EPSA) no tienen similitud significativa con secuencias de glicosiltransferasas depositadas previamente en esta base de datos, por lo que se considera la posibilidad de haber asilado un par de cepas productoras de nuevos EPS. (2) El aislamiento de varias cepas de bacteriae lácticas y la evaluación inicial de su potencial como cepas probióticos permitió detectar 13 aislados identificados como especies del género Leuconostoc, capaces de sobrevivir a condiciones de pH ácido (3.5) y a la presencia de sales biliares (0.3%). Este resultado es de gran relevancia ya que tradicionalmente las especies de Leuconostoc han sido consideradas como microorganismos no tolerantes a condiciones de acidez (Stiles and Holzapfel). Dos de estos aislados sobrevivieron a estas condiciones que simulan el efecto antimicrobiano del estómago y del intestino delgado (Mattila-Sandholm, 2005; Reid, 2008), mejor que una cepa probiótica comercial utilizada como control. La evaluación de la capacidad antimicrobiana de estos aislados contra los microorganismos patogénicos Escherichia coli EPEC, Listera monocitogenes, Salmonella typhi y S. typhimurium, demostraron que estos dos aislados poseen una capacidad de inhibición del crecimiento de estos patógenos en condiciones in vitro, muy superiores a la cepa probiótica comercial. En la presente propuesta que se plantea para un período de dos años, se pretende continuar con la caracterización de las diferentes cepas de Leuconostoc aisladas a partir del pulque con capacidad de producción de EPS y aquellas bacterias lácticas identificadas también como diferentes especies del género Leuconostoc, con posible capacidad probiótica. En cuanto al estudio de los EPS denominados como EPSA y EPSB se pretende concretar la caracterización de estos polímeros desde el punto de su relación estructural con la célula en condiciones de producción (en presencia de sacarosa) por técnicas de microscopía electrónica de barrido y de transmisión; caracterización molecular y cinética de las enzimas involucradas en su síntesis; caracterización por RMN del EPSA y la obtención del gen completo que codifica la glicosiltransferasa para ambos EPS. En el contexto de la caracterización de las cepas de bacterias lácticas con capacidad probiótica, se pretende ampliar el espectro del efecto inhibitorio a Helicobacter pylori y Clostridium difficile (Mattila-Sandholm et al., 2002; Reid, 2008); la evaluación de la capacidad in vitro e in vivo de adherencia células epiteliales intestinales, la capacidad de inhibición de microorganismos patogénicos y el estudio del posible papel de los EPS producidos por estos aislados en los mecanismos de inhibición y adherencia (Limonet et al., 2004). Los resultados que se obtengan de este proyecto de investigación permitirán obtener información de gran relevancia sobre la diversidad genética y microbiana presente en el pulque y el aislamiento y caracterización de nuevos productos y actividades de interés biotecnológico. Esta información permitirá a su vez, sentar las bases científicas de algunas de las propiedades promotoras de la salud, asociadas tradicionalmente al consumo de esta bebida. Por otro lado, las cepas de bacterias lácticas aisladas y caracterizadas permitirán incrementar una colección de cepas de bacterias Gram-positivas y Gram-negativas aisladas a partir de muestras de esta bebida en trabajos previos de nuestro grupo de investigación, como parte del interés por preservar la diversidad bacteriana de esta bebida. Los resultados parciales y finales de este proyecto se pretenden publicar en revistas internacionales arbitradas, ser presentados en congresos o simposios nacionales e internacionales y permitirá también la formación de recursos humanos a nivel licenciatura y maestría.

Los resultados que se obtengan de este proyecto de investigación permitirán: 1. Obtener información sobre la diversidad genética y microbiana presente en el pulque. Los estudios realizados previamente por nuestro grupo de trabajo enfocados al análisis de la diversidad cultivable y no cultivable en muestras de pulque de diferente origen geográfico y durante una fermentación realizada en laboratorio, permitieron la identificación y aislamiento de especies bacterianas previamente reportadas para esta bebida y de forma importante, una gran diversidad de nuevas especies (Escalante et al., 2004; 2008), aportando nueva información sobre la diversidad bacteriana presente en esta bebida. Es importante destacar que en un período de poco más de 20 años no existen trabajos sobre la diversidad bacteriana del pulque (Godoy, 1987; García –Garibay y López-Munguía, 1993). La información obtenida de nuestros análisis de la diversidad bacteriana del pulque permitieron identificar a las bacterias lácticas identificadas como Lactobacillus acidophilus y diversas especies de Leuconostoc (diferentes a L. mesenteroides), presentes en una alta proporción (más del 80%, para el caso de L. acidophilus) y a bacterias ácido acéticas como microorganismos de importancia durante la fermentación, con un papel aún por determinar. 2. El aislamiento y caracterización de nuevos productos y actividades de interés biotecnológico, para este caso, específicamente dos nuevos exopolisacáridos (glucanas) producidos por Leuconostoc citreum y diversas especies de Leuconostoc con potencial probiótico. 3. Evaluar el papel de los EPS producidos por los aislados con capacidad probiótica en la capacidad antimicrobiana y de adherencia a células epiteliales de estas cepas. 4. La información obtenida de la caracterización de las cepas de bacterias lácticas con capacidad probiótica permitirá, sentar las bases científicas de algunas de las propiedades promotoras de la salud, asociadas tradicionalmente al consumo esta bebida. 5. Por otro lado, las cepas de bacterias lácticas aisladas y caracterizadas permitirán incrementar una colección de cepas de bacterias Gram-positivas y Gram-negativas aisladas a partir de muestras de esta bebida en trabajos previos de nuestro grupo de investigación, como parte del interés por preservar la diversidad bacteriana de esta bebida. 6. Los resultados finales de este proyecto se pretenden publicar en revistas internacionales arbitradas: (a) Identificación y caracterización de dos nuevos polisacáridos extracelulares y (b) Aislamiento y evaluación de las propiedades probióticas in vitro e in vivo de bacterias lácticas aisladas del pulque. Los resultados parciales y finales de este proyecto serán presentados en congresos nacionales e internacionales: 5° Simposio Internacional de Probióticos a celebrarse en el año 2010 en México D.F. y el XIV Congreso Nacional de Biotecnología y Bioingeniería a celebrarse en el año 2011. 7. Se incorporan a este proyecto como tesistas de licenciaturas las alumnas Violeta Matus Acuña e Ingrid Torres Rodríguez, estudiantes del último semestre de la carrera de Química de Alimentos, Facultad de Química, UNAM y se espera la incorporación de una alumna de maestría para el semestre 2010-2.