El desarrollo del sistema nervioso central en el embrión es un proceso altamente dinámico; la especificación de la posición e identidad correcta de las células que forman la estructura requiere la integración de multitudes de señales que cambian su forma, concentración y localización conforme al tiempo y la remodelación constante del entorno. El proyecto se basa en identificar y caracterizar algunos de los estadios intermediarios que las células indiferenciadas transitan durante su diferenciación hacía neuronas dopaminérgicas mesencefálicas (nDAmes)._x000D_ _x000D_ Implementaremos un modelo experimental de trasplante de células indiferenciadas derivadas de los células troncales de raton (mESC por sus siglas en inglés) en explantes del mesencéfalo embrionario de ratón, que es el entorno endógeno en donde se forman las nDAmes. Éste tiene ciertas ventajas sobre los modelos más tradicionales 100% in vitro, siendo que el explante preserva las señales locales y los gradientes de morfógenos, mismos que instruyen a los precursores neurales a diferenciarse hacía la identidad neuronal correcta. Otra ventaja es que con mucha facilitad podemos manipular genéticamente las mESC in vitro, lo cual nos permite trasplantar células que expresan genes reporteros, o que no expresan componentes de vías de señalización, o que sobreexpresan los mismos componentes. El modelo nos permite estudiar la interacción entre el entorno (y toda la información que contiene) y las células indiferenciadas, las cuales son capaces de interpretar la información para diferenciarse correctamente._x000D_ _x000D_ Hasta ahora la caracterización del modelo trasplante-explante se han hecho con células del cuerpo embrioide (EBCs), una etapa intermediaria entre las mESC y los células precursores neurales (NPCs). Las EBCs tienen plasticidad para adquirir una identidad local correcta después de trasplantar y diferenciarse en el explante, una capacidad que es prácticamente ausente en las mESC y las NPCs. Sin embargo, las EBCs son una población de células heterogénea y no muy bien definida, lo que efectivamente limita la eficiencia, reproducibilidad e interpretación de la diferenciación pos-trasplantación. Como alternativa, se han desarrollado un protocolo para generar las NPCs a partir de la diferenciación controlada de las monocapas de las mESC. Aunque su eficiencia en generar neuronas dopaminérgicas in vitro es muy similar a los mejores métodos alternativos (solo 10-15% de las neuronas totales usando protocolos estándares) cuenta con la ventaja de ser más rápido y reproducible, y más fácil de adaptar a los estudios dinámicos por microscopía de células vivas. Explotaremos la homogeneidad relativa de ésta población de células para identificar y determinar el momento durante las etapas iniciales de la diferenciación in vitro en lo cual las células tienen mayor plasticidad para adquirir identidades locales y diferenciarse correctamente después de ser trasplantadas en explantes del mesencéfalo embrionario._x000D_ _x000D_ Una vez establecida, adaptaremos el sistema para determinar si durante la diferenciación de las mESC hacía ser nDAmes, las células adoptan la identidad de células de placa del piso mesencefálico, mismo que ocurre durante la diferenciación de las nDAmes endógenas._x000D_

Originalidad_x000D_ La originalidad del proyecto en términos científicos se basa en identificar en qué momento, después de iniciar su diferenciación, las células precursoras que tiene mayor plasticidad para interpretar las señales presentes en el entorno endógeno de neurogénesis dopaminérgica después de su trasplantación. Es una pregunta de importancia contundente, por que las terapias de trasplantación de células derivadas de las ESC son unas de las estrategias más intensamente estudiadas para encontrar un tratamiento para la enfermedad de Parkinson, en las cuales las células trasplantadas deben reemplazar la función de las nDAmes degeneradas. Para asegurar la confiabilidad y eficiencia de las futuras terapias, tenemos que identificar la clase de células precursores que tienen mayor eficiencia en especificarse y diferenciarse correctamente in situ después de su trasplantación. Como materia prima para generar células trasplantables, las ESC (con sus calidades de ser pluripotentes y relativamente fácil mantener, expandir, diferenciar y manipular genéticamente in vitro) son muy prometedoras. Sin embargo, aún queda mucho para determinar sobre su biología celular básica y los mecanismos que dirigen la diferenciación de las ESCs hacía un destino u otro. El propósito de la propuesta es poder identificar el mejor momento para llevar las células precursoras primitivas a trasplantar, en términos de su capacidad de adquirir la identidad neuronal correcta en el entorno endógeno de neurogénesis dopaminérgica. La existencia de tal clase de célula se sabe por resultados recién publicados del laboratorio, sin embargo las células trasplantadas en el estudio fueron una población heterogénea y difícil de identificar, por su origen en el cuerpo embrioide. La propuesta se basa en implementar un mecanismo alternativa para derivar las precursores trasplantables que nos debería permitir reducir la heterogeneidad en la población de células trasplantadas, por tener más control sobre las condiciones iniciales de diferenciación de las mESC, siendo un método más rápido y sincronizado. Esto representaría un paso adelante en definir los parámetros importantes para crear una terapia de reemplazo de función mediante la trasplantación de células en los cerebros de los pacientes de PD._x000D_ Del lado técnico, proponemos desarrollar técnicas para estudiar la diferenciación de las mESC in vitro en tiempo real de modo continuo a nivel de célula única. Esas técnicas son pocas empleadas en el estudio de neurogenesis, y estarán en la vanguardia del estudio de la diferenciación dopaminérgica, y proporcionarán información dinámica sobre la temporalidad de la expresión de factores importantes y que participan en el proceso. Esta calidad de información es difícil obtener por métodos alternativos, y profundizará y mejorará lo que se comprende del mecanismo de neurogenesis dopaminérgica mesencefálica._x000D_ Las líneas de mESC transgénicas que proponemos generar de manera expeditada por el uso de recombinación dirigida a un sitio genómico específico servirán como herramientas básicas para el estudio de diferenciación, algunas como la línea mESC:Pitx3:RFP dentro del contexto de la neurogenesis dopaminérgica, y otros dentro de otros contextos neurgenéticos (como la del mESC:Shh:GFP) o de diferenciación de diversas linajes celulares (e.g. mESC:NodalEI2:GFP)._x000D_ Producción científica y formación de recursos humanos _x000D_ Al final de los tres años de duración de la propuesta se espera haber completado 2 publicaciones científicas originales en revistas internacionales con arbitraje estricto: una al completar el objetivo B; y 1 al completar el objetivo C._x000D_ Durante el periodo de la propuesta se planea graduar al menos dos tesitas de licenciatura y uno de maestría, e incorporar un estudiante de postgrado en el Doctorado en Ciencias Bioquímicas, dos estudiantes en la maestría en Ciencias Bioquímicas y una tesista de licenciatura._x000D_ Un estudiante de maestría, dos tesistas de licenciatura y el responsable técnico presentarán sus trabajos en dos congresos internacionales en el segundo y tercer año (1 congreso para cada tesista de licenciatura._x000D_ De lograr identificar cuáles de las etapas iniciales de la diferenciación de las mESC genera células trasplantables con mayor plasticidad para especificar y integrarse correctamente en el entorno endógeno neurogenético del mesencéfalo, se sometería la información en una patente para mejorar la eficiencia en generar precursores correctamente especificados in vitro como materia prima para terapias regenerativas para la enfermedad de Parkinson._x000D_