La entrega de materiales a las células es uno de los retos más importantes de la medicina, ya que muchas substancias no son biocompatibles. Una solución ha sido utilizar vehículos para su entrega. Sin embargo, la mayoría de los vehículos son poco eficientes para alcanzar y entrar a la célula blanco, y son poco específicos. En contraste, los virus son muy eficientes para llegar a sus tejidos blanco y tienen un tropismo definido y específico. En este proyecto proponemos el uso de partículas pseudovirales (PPV) recombinantes de virus adeoasociado tipo 2 (VAA-2) como vehículo para la entrega de sustancias. El VAA ha sido extensamente utilizado como vector para terapia génica, ya que son muy eficientes para la entrega de genes aún a células que no están en división. Existen 14 tipos de VAA, en donde varios de ellos tienen tropismo específico a algún tejido en particular. Aprovechando estas características del VAA, el sistema de entrega propuesto aquí será altamente eficiente y específico. En este proyecto expresaremos de forma recombinante a las 3 proteínas estructurales de VAA-2 en el sistema células de insecto-baculovirus. Las proteínas así expresadas se ensamblan espontáneamente en estructuras prácticamente idénticas a la cápside nativa, pero que carecen del material genético viral, las PPV. Las PPV conservan las características de unión y entrada a la célula del virus original. _x000D_ Con el fin de evaluar la posibilidad de utilizar a las PPV de VAA-2 como vehículos para la entrega de substancias, en este proyecto estudiaremos desde el sitio de ensamblaje de PPV dentro de la célula de insecto, hasta su comportamiento en varias condiciones fisicoquímicas. Primeramente, determinaremos el sitio y eficiencia de ensamblaje de PPV dentro de las células de insecto. Posteriormente, evaluaremos el efecto de diferentes composiciones de PPV en la capacidad de unión e internalización a células humanas en cultivo. Desarrollaremos métodos de purificación altamente eficientes de PPV, con el fin de obtener preparaciones con muy alta pureza que nos permitan estudiar los cambios conformacionales que sufren las PPV al someterlas a diferentes condiciones. Con base en los resultados obtenidos, desarrollaremos un sistema de encapsidación de un fluróforo modelo que estará basado en la entrada del fluoróforo por los canales propios de la PPV en ciertas condiciones por definir, o su encapsulación a partir del ensamblaje in vitro de las PPV. Ya con los vehículos cargados, procederemos a evaluar la capacidad de entrada y entrega en la célula. Este proyecto constituirá los primeros pasos hacia contar un sistema de entrega de sustancias aprovechando las propiedades de los VAA. Adicionalmente, los resultados obtenidos incrementarán el conocimiento cobre el comportamiento de estos virus en diferentes condiciones ambientales._x000D_

El uso de potenciales agentes terapéuticos o de diagnóstico se ve frecuentemente limitado por su incompatibilidad biológica, poca especificidad o por parámetros farmacocinéticas o farmacodinámicos inadecuados. Para resolver estos problemas, se han utilizado sistemas de entrega de medicamentos. Sin embargo, la mayoría de estos sistemas son poco específicos o poco eficientes para la entrega de la sustancia de interés a la célula blanco. En este proyecto se propone explorar la utilidad de un nuevo sistema de entrega basado en partículas pseudovirales recombinantes de virus adenoasociado tipo 2 (VAA-2). Se espera que los vehículos obtenidos serán muy eficientes para la entrega de la sustancia de interés, así como muy específicos para ciertos tejido blanco. Con el fin de lograr este objetivo a largo plazo, en el proyecto propuesto aquí se contribuirá en los siguientes campos:_x000D_ _x000D_ Conocimiento básico_x000D_ 1. Incrementar el conocimiento de las cinéticas de ensamblaje de proteínas de virus adenoasociado, así como de las condiciones que promueven el desensamblaje del virus._x000D_ 2. Entender como la relación entre las tres proteínas estructurales de VAA-2 determinan la capacidad de virus de unión e internalización a la célula._x000D_ 3. Entender el efecto de condiciones fisicoquímicas en la estructura de VAA, información que puede ser extrapolada al comportamiento in vivo del virus._x000D_ _x000D_ Desarrollo tecnológico_x000D_ Se espera obtener las herramientas necesarias para la producción y purificación de partículas pseudovirales recombinantes de VAA-2, con el objetivo a largo plazo de contar con un sistema de entrega de sustancias. Se espera generar propiedad intelectual que pueda resultar en una aplicación de patente. Específicamente, se realizarán las siguientes contribuciones:_x000D_ 1. Obtener un sistema de purificación escalable, económico y eficiente que permita obtener altas cantidades de partículas pseudovirales de VAA-2 con alta pureza y concentración._x000D_ 2. Contar con sistemas analíticos robustos que permitan caracterizar el producto obtenido, además de evaluar el desempeño del mismo en circunstancias diversas._x000D_ 3. Contar con una tecnología para la encapsidación de sustancias químicas en partículas pseudovirales deVAA-2._x000D_ 4. Primeras evaluaciones sobre la factibilidad técnica del acercamiento propuesto en este proyecto._x000D_ _x000D_ Formación de recursos humanos_x000D_ Se formarán recursos humanos altamente capacitados en un área con alto valor y altamente especializada. Se formarán 2 alumnos de doctorado y dos alumnos de maestría, además de un técnico académico._x000D_ _x000D_ Productividad científica_x000D_ Se espera producir durante la etapa de desarrollo del proyecto al menos tres artículos en revistas internacionales indexadas, además de realizar diversas presentaciones en congresos. _x000D_