Pequeñas moléculas de RNA de 20-24 nucleótidos, conocidas como microRNAs (miRNAs) actúan como factores reguladores de la expresión genética tanto en animales como en plantas (Bartel, 2004). Los miRNAs participan de distintas formas en el desarrollo y en respuesta a fitohormonas en la planta modelo Arabidopsis thaliana (Kidner and Martienssen, 2005). En respuesta a factores ambientales, tales como estrés y en particular aquél por falta de agua, se ha iniciado el análisis de su participación en A. thaliana (Sunkar and Zhu, 2004). En particular, se ha mostrado que durante la germinación miR159 se induce por sequía o por la presencia de la fitohormona ácido abscísico (ABA) que está íntimamente relacionada con la respuesta a limitación de agua (Reyes and Chua, 2007). Sin embargo, en otras especies se conoce poco de su participación en estos eventos, y sólo recientemente se han estudiado miRNAs en respuesta a frío en Populus (Lu et al., 2008) y en respuesta a sequía en arroz (Zhao et al., 2007). El papel de los miRNAs en la regulación post-transcripcional sólo puede ser entendido a plenitud si conocemos los mensajeros que son regulados y en consecuencia los procesos celulares que se ven afectados. La identificación de dichos transcritos blanco es una parte integral de esta propuesta y el objetivo principal de nuestros estudios en un futuro próximo. En este proyecto utilizamos Phaseolus vulgaris como modelo para estudiar la función de los miRNAs en respuesta a diferentes estímulos ambientales en una planta de interés agronómico. Nuestra meta es estudiar los miRNAs involucrados en la respuesta a estrés hídrico en distintas etapas de desarrollo de la planta. Aunque la utilización de P. vulgaris como modelo experimental representa un reto por las limitaciones que aún tiene, en nuestro grupo de trabajo hemos avanzado en el conocimiento de diferentes aspectos de su respuesta al estrés hídrico, tanto a nivel molecular como fisiológico. Por otro lado, consideramos que por ser una planta de interés agronómico, representa una oportunidad para conocer nuevos mecanismos regulatorios mediados por miRNAs implicados en la adaptación al estrés hídrico. Además, si los miRNAs identificados en frijol están presentes en otras leguminosas, nuestros hallazgos tendrán mayor relevancia al ser útiles en el estudio de otras plantas que también poseen interés agronómico. A la fecha, hemos identificado nuevos miRNAs en frijol mediante la clonación de RNAs pequeños presentes en condiciones de estrés y nodulación así como a través de un análisis posterior tanto bioinformático como experimental (Arenas et al., Sometido). En el presente proyecto trataremos de extender nuestro conocimiento de la función de los miRNAs identificando sus mRNAs blanco. Para ello utilizaremos como herramienta principal el aislamiento de complejos multiproteicos que contienen miRNAs asociados y donde podremos identificar otros elementos, como los mensajeros sujetos a regulación por miRNAs. Cabe mencionar que algunas de las limitaciones para esta etapa del proyecto son las mismas que las que planteamos anteriormente para la fase de identificación de miRNAs, es decir, la falta de la secuencia completa del genoma de P. vulgaris, así como el número limitado de secuencias expresadas (en forma de ESTs y/o cDNAs) lo que implica el desarrollo de nuevas herramientas de análisis que nos permitan identificar dichos mensajeros blanco. Estos son los aspectos que pensamos desarrollar e implementar en la presente propuesta. La identificación de nuevos miRNAs en frijol, junto con el análisis de los mensajeros regulados por los mismos, nos dará una idea de la relevancia biológica de este mecanismo de regulación para la respuesta a estrés, así como de la diversidad de procesos afectados por los miRNAs de plantas en general.

Además de caracterizar los miRNAs conservados de frijol, hemos encontrado algunas secuencias que representan miRNAs propios de frijol y otras leguminosas. Hasta el momento hemos identificado miRNAs nuevos propios de frijol y otras leguminosas como soya (Arenas et al., sometido; Subramanian et al., 2008). Por lo anterior, hemos profundizado en su estudio con el objetivo de entender su participación en la regulación de los procesos celulares en frijol, en particular aquellos procesos relacionados con la respuesta a estrés hídrico. Actualmente estamos analizando otras bibliotecas de RNAs pequeños provenientes de otras condiciones de crecimiento de frijol, como son hojas adultas con tratamiento de sequía, e incluso continuar con la construcción de una biblioteca de raíces de frijol noduladas por Rhizobium, y otra derivada de plantas infectadas por el virus BCMV (Bean Common Mosaic Virus). Pensamos que cada una de estas bibliotecas puede mostrarnos distintos aspectos del control de la expresión genética en frijol frente a distintos estímulos ambientales. De las bibliotecas que obtuvimos inicialmente y, como describimos más arriba, hemos identificado miRNAs propios de leguminosas. Estamos convencidos de que podemos seguir identificando nuevos RNAs pequeños reguladores si analizamos las condiciones que se han mencionado y ayudarán a un mejor entendimiento del repertorio de respuestas a nivel molecular adoptadas por frijol para contender con distintos estímulos ambientales. Dado que hemos encontrado que los miRNAs de frijol están presentes también en otras leguminosas como soya o Medicago truncatula, nuestros resultados podrán ser extrapolados a entender las estrategias de adaptación al medio ambiente en estas otras plantas de interés agronómico.