La síntesis y secreción de prolactina son procesos que dependen de la actividad de los canales de Ca2+ dependientes de voltaje (CaVs) de los lactotropos. En estas células los cambios del potencial de membrana ocasionan la apertura de los canales CaV y con ello un incremento brusco de la concentración de Ca2+ intracelular lo que provoca la activación de vías de señalización que conducen a la movilización de las vesículas de secreción, su aproximación y fusión a la membrana celular, para finalmente vaciar su contenido en el espacio extracelular. La regulación de la secreción de prolactina se ha estudiado en una línea celular derivada de un adenoma hipofisiario de la rata denominada GH3 en la que se han reconocido diferentes factores que promueven o inhiben su liberación por medio de modificar la actividad de los canales CaV. Entre estos, se ha visto que la insulina favorece la secreción de prolactina por medio de incrementar la expresión funcional de los canales CaV de bajo umbral de activación (LVA o tipo T). Existen evidencias de que este efecto pudiera ser postraduccional, sin embargo, hasta el momento se desconocen los mecanismos moleculares que determinan el incremento de la corriente de tipo T causado por la insulina. _x000D_ Considerando que el reciclaje de los canales iónicos en general y de canales de Ca2+en particular es un mecanismo para regular su número en la membrana celular, estudios recientes han propuesto que el aumento en el reciclamiento de los canales endocitados en vesículas pudiera mediar algunos de los procesos que incrementan la expresión funcional de dichos canales. Precisamente, el propósito central de este trabajo es investigar la participación del reciclamiento de canales de Ca2+ de tipo T en las células GH3 durante la secreción de prolactina estimulada por insulina. En este sentido se ha mostrado que las GTPasas pequeñas de la familia Rab son elementos cruciales de la maquinaria que controla el reciclamiento de proteínas hacia la membrana celular, y entre ellas se ha destacado el papel de Rab11 en la reincorporación de los canales de Ca2+ cardiacos y neuronales. _x000D_ En la primera fase de este trabajo se caracterizará el efecto de la insulina sobre la secreción de prolactina en las células GH3, y se confirmará la expresión de canales T (CaV3.1), Rab 11 y del receptor a insulina en esta línea celular. Simultáneamente se obtendrá una construcción de los canales T recombinantes CaV3.1 con un epítope de hemaglutinina (CaV3.1-HA), por medio de la cual se dará seguimiento a este tipo de canales durante su expresión heteróloga. En la segunda fase de la presente investigación, se expresarán dos mutaciones de Rab11 en células HEK-293 junto con canales CaV3.1-HA, para definir si el incremento de la corriente T inducido por la insulina depende de un aumento en el número de canales reciclados a la membrana celular. _x000D_ La hipótesis de la presente propuesta predice que el uso de una dominante positiva de Rab11, la mutante Q70L podría favorecer la reinserción de canales a la membrana celular. En contraste, la expresión de la mutante dominante negativa S25N podría prevenir el incremento de la corriente T en células tratadas con insulina. Los efectos de las mutantes de Rab11 se definirán por medio de las técnicas de citometría de flujo y patch-clamp. En la fase final de la investigación, para confirmar la relevancia de Rab11 en la secreción hormonal en las células GH3 se usarán ARNs pequeños de interferencia (siRNAs) para el silenciamiento del gen que codifica la proteína y de esta manera reducir el reciclamiento de los canales nativos. El silenciamiento de Rab11 se confirmará por Western-blot y sus efectos sobre el reciclamiento de canales de tipo T se analizarán por medio de la técnica de patch-clamp._x000D_ Hasta el momento pocos estudios se han enfocado a investigar la relevancia del reciclamiento de canales iónicos, incluso se ha llegado a dudar que los canales CaV puedan ser reinsertados en la membrana celular después de ser removidos. Considerando lo anterior, identificar al reciclamiento de los canales T como un mecanismo involucrado en la regulación de procesos fisiológicos tan relevantes como la secreción hormonal podría abrir nuevos horizontes en estudios de fisiología y endocrinología molecular._x000D_

La relevancia de los canales de Ca2+ dependientes de voltaje (CaVs) solo puede ser valorada al atender a la gran diversidad de procesos intracelulares que dependen de Ca2+, entre los que destacan la regulación genética, la actividad enzimática, la contracción muscular, la neurotransmisión y la secreción hormonal. Considerando el papel fundamental en la homeostasis del Ca2+ los canales CaV han sido el objeto de un gran número de trabajos de investigación en la mayoría de los cuales se trata de definir como son regulados. Y aunque uno de los aspectos más estudiados es el tránsito intracelular de los canales poca atención se ha dado al reciclamiento, esto es, el mecanismo por el cual los canales podrían ser reincorporados a la membrana celular después de haber sido retirados por medio de endosomas. Este proceso involucra un importante ahorro a la economía celular al evitar la síntesis de nuevos canales y disponer en corto plazo de una dotación de canales que al llevarse nuevamente a la membrana permitirán la entrada de Ca2+ en respuesta a los cambios del potencial de membrana de igual manera que los canales recién sintetizados. Para los canales CaV neuronales se ha reportado que la GTPasa pequeña Rab11 es importante durante el reciclamiento de los canales permitiendo que la proteína de unión a actina Kelch-like 1 (KLHL1) interactué con los filamentos de esta proteína para favorecer la reinserción de los canales. Sin embargo, hasta el momento no hay indicios del reciclamiento de los canales CaV de las células endocrinas, lo cual se perfilaría como un posible mecanismo de la regulación de la secreción hormonal.