La leishmaniasis es causada por parásito protozoario del género Leishmania, que infecta a humanos y a otras especies de mamíferos. En México la especie más común es Leishmania mexicana y el vector comprobado de transmitirla es el flebótomino Lutzomyia olmeca (1,2). Durante la picadura de la mosca transmisora el parásito es inoculado en la dermis del hospedero junto con componentes salivales del flebótomo, causando leishmaniasis cutánea de distinta severidad: la leishmaniasis cutánea localizada (LCL) y la leishmaniasis cutánea difusa (LCD. Aun se sabe poco sobre los factores que participan en la susceptibilidad de pacientes con LCD para padecer la forma progresiva del padecimiento (3). Nuestro grupo de trabajo se ha abocado a estudiar la respuesta inmune innata en la leishmaniasis y demostramos por primera vez que LPG (lipofosfoglicano) de Leishmania activa receptores TLR2 en células NK (4).En el proyecto anterior (IN221806-3) encontramos que la activación de TLR2 en células NK de pacientes con LCL induce la producción de citocinas (IFN-gama y TNF-alfa), lleva a sobre-expresión de TLR2 e induce actividad citotóxica sobre macrófagos autólogos infectados con Leishmania. En contraste, las células NK de pacientes con LCD no responden al estímulo de TLR2 y muestran inhibición de su respuesta citotóxica, uno de los mecanismos leishmanicidas más importantes (manuscrito en preparación). Buscamos si la distinta susceptibilidad a la leishmaniasis entre ambos grupos de pacientes radica en variabilidad genética relacionada con TLR2 y citocinas pro-inflamatorias. Encontramos que polimorfismos en nucleótidos (SNPs) de la citocina pro-inflamatoria IL-1beta representan un factor de riesgo para leishmaniasis. Con esta información iniciamos el análisis de las características de la respuesta inflamatoria en modelos murinos de leishmaniasis de distinta susceptibilidad y encontramos que la susceptibilidad a la leishmaniasis se asociaba con una intensa inflamación temprana (6 horas) inducida por células cebadas (5)que se asociada con un infiltrado masivo de leucocitos polimorfonucleares (PMN), que han sido descritos como células facilitadoras de la infección por su capacidad de transportar al parásito. En resumen, los resultados del proyecto anterior sugieren dos factores de riesgo para la leishmaniasis: 1) inflamación temprana mediada por células cebadas y 2) inhibición de mecanismos citotóxicos sobre macrófagos infectados con Leishmania. En el presente proyecto planteamos continuar explorando los mecanismos inflamatorios y citotóxicos asociados con la susceptibilidad a la leishmaniasis. Queremos continuar con el estudio de las moléculas y mecanismos que participan en la inflamación y en la actividad citotóxica en leishmaniasis con un análisis de cebadas y células NKT y su repercusión en la leishmaniasis. En el presente proyecto proponemos analizar los siguientes puntos: 1.- Queremos analizar moléculas que pueden activar a células cebadas durante la infección por Leishmania, tanto endógenas como exógenas. Entre las exógenas se encuentran componentes salivales de la mosca transmisora (Lutzomyia), que contiene componentes farmacológicamente activos, como el Maxadilan, un potente vasodilatador que facilita la hemofagia. Aun no se ha estudiado su efecto sobre células cebadas. Otra molécula moduladora de células cebadas es LPG de Leishmania a través de TLR2, sin embargo aun se desconoce su participación en la desgranulación. Entre los factores endógenos se encuentra IL-33, liberada por queratinocitos activados, que induce la producción de IL-17 por células cebadas, una molécula fuertemente quimiotáctica para PMN. 2.- Analizaremos si estas moléculas inducen la liberación de citocinas proinflamatorias (IL-1beta, TNF-alfa, IL-17), quimiocinas (LTB4 y CXCL8)asi como la degranulación con liberación de mediadores vasoactivos preformados (histamina y TNF-alfa) en las células cebadas y si esto ocurre a través de TLR2. Dado que histamina, CXCL4, LTB4 e IL-17 ejercen un efecto quimiotáctico importante sobre los PMN, será interesante analizar la participación de los distintos activadores de células cebadas en su producción. 3.- En modelos de ratones con distinta susceptibilidad a la infección por Leishmania mexicana (BALB/c, C57BL/6 y C3H/HJ) estudiaremos si los componentes salivales de Lutzomia modifican el curso de la infección por Leishmania, analizaremos la carga parasitaria así como las características del infiltrado inflamatorio en las lesiones a distintos tiempos de la infección. 3.- Otra de las células que posiblemente participe de manera crucial en la respuesta innata inflamatoria es la célula NKT, productora de citocinas proinflamatorias como TNF-alfa e IL-17, es una célula citotóxica y adicionalmente migra a la dermis durante infecciones. Las células NKT se caracterizan por tener la capacidad de reconocer glicolípidos mediante dos receptores distintos: puede reconocerlos por su TCR invariante cuando son presentados a través de moléculas CD1d por células dentríticas o bién los puede reconocer mediante TLR2. Esto posiciona a las células NKT en una posición privilegiada para reconocer patrones moleculares como LPG de Leishmania, permitiéndole desempeñar un papel dual en la leishmaniasis: a pueden favorecer la inflamación temprana mediante la produción de factores como TNF-alfa e IL-17 induciendo la llegada de PMN que favorecen la progresión de la enfremedad, b)pueden mediar protección en lesihmaniasis através de su actividad citotóxica. En el presente proyecto se analizará la capacidad citotóxica de células NKT sobre macrófagos autólogos infectados con Leishmania mexicana. Analizaremos los receptores que participan así como las moléculas efectoras (granzimas y perforinas o FASL). 4.- Analizaremos las características de las citocinas liberadas por células NKTcuando son estimuladas con LPG. Analizaremos las vías de señalización que participan en la activación de la célula. 5.- Estudiaremos si TLR2 regula la exocitsis y en las citocinas cuando las células NKT son estimuladas con LPG o con células dendríticas pulsadas con LPG o con alfa-galactosilceramida. 6.- Estudiaremos las células del infiltrado inflamatorio (células cebadas, células NKT, PMN) así como las citocinas proinflamatorias en las lesiones de pacientes con LCL y LCD así como en ratones susceptibles y resistentes a la leshmaniasis. 7.- Continuaremos con el análisis de polimorfismos en mediadores de la inflamación en muestras de sangre de pacientes con LCL y LCD, así como buscar una asociación entre los polimorfismos y la susceptibilidad a la leishmanaisis. Tomando en cuenta los datos anteriores, en el presente proyecto se pretende definir la importancia de la inflamación temprana en la patogenia de la leishmaniasis mediante el análisis de: 1) los factores activadores de la célula cebada, con un estudio de los mediadores inflamatorios que libera la célula cebada durante las primeras etapas de la infección con Leishmania mexicana; 2) la participación de las células NKT en la inflamación mediante un estudio de sus receptores, de sus vías de activación, de sus mecanismos efectores y de su distribución microanatómica en las lesiones por Leishmania, lo cual permitirá entender su papel como mediadora de la inflamación y célula citotóxica durante los eventos tempranos de la infección, que posiblemente definen la evolución de la leishmaniasis.

Este proyecto permitirá estudiar las primeras fases de la inflamación y su papel en la leishmanisis. Permitirá desglozar tanto los aspectos protectores como los aspectos facilitadores que ejerce la inflamación en esta parasitosis. En la literatura se había reportado que la presencia temprana de neutrófilos en modelos experimentales de leishmanisis se asociaba con la susceptibilidad. Adicionalmente se había reportado que el parásito inhibe la apoptosis en los neutrófilos, favoreciendo que la célula lo transportara fuera del sitio de la infección. En conjunto, los antecedentes parecen indicar que el neutrófilo desempeñaba un papel facilitador para la diseminación del parásito.Sin embargo, no se entendía las células y los mecanismos que regulan la afluencia de los neutrófilos y modulan los eventos tempranos de la infección. Los antededentes de nuestro grupo parecen indicar que la fase temprana de la inflamación ejerce un efecto facilitador en esta parasitosis mientras que la fase tardía de la inflamación ejercía un efecto protector. El presente proyecto permitirá estudiar detalladamente las distintas fases de la inflamación en la leishmaniasis, aportando nuevos conocimientos sobre las células y los mecanismos que regulan las distintas fases. Los datos que se podrán obtener ayudarán a entender los mecanismos fisiopatogénicos iniciales de la infección por Leishmania y servrán para un mejor diseño de métodos terapuéuticos y preventivos en esta parasitosis.