Además de fluir a través del poro de canales de K+, el ión K+ es un cofactor crítico de éstas proteínas ya que: mantiene la estabilidad de la conductancia GK de los canales (i.e., mantiene la capacidad de conducir iones (K+) del poro). En ausencia de K+ o interesantemente con [K+] menores a las fisiológicas (i.e., en hipokalemia) la GK de varios canales de K+ (aunque interesantemente no la de todos los que se han estudiado) se colapsa, como lo demostramos nosotros estudiando los canales Shaker (Gomez-Lagunas, 1997). El mecanismo fisicoquímico y las bases estructurales de esté fenómeno y de sus diferencias en distintos tipos de canales no se conoce. El presente estudio de los rectificadores tardíos Shab contribuirá a entender el mecanismo de este proceso._x000D_ Específicamente, GK de Shab se colapsa irreversiblemente cuando los canales son inmersos en soluciones sin K+. GK cae exponencialmente con los canales mantenidos cerrados en el HP, con una constante de velocidad de ~800 sec a -80 mV (Gomez-Lagunas, 2007). La facilidad con la que GK se colapsa en nos lleva a formular la hipótesis de que: el ión K+ más externo del poro (unido en s1/s2) es el que mantiene GK estable. _x000D_ Recientemente (observaciones no publicadas) encontramos que el TEA externo (TEAo) bloquea Shab con una Kd de ~12 mM a 0 mV, y sin embargo no inhibe el colapso de GK en 0 K+, sino que lo facilita. Esto contrasta con lo reportado en Shaker donde el TEAo inhibe el colapso de GK con una Kd idéntica a la de su bloqueo (Gomez-Lagunas, 1997). _x000D_ Estas observaciones nos permiten formular las siguientes hipótesis cuyo estudio constituye el objetivo del presente proyecto:_x000D_ _x000D_ 1. El TEAo facilita el colapso de GK de Shab debido a que, en estas condiciones iónicas, desplaza al ión K+ que da estabilidad a GK. Sin que el TEA por si mismo sea capaz de mantener la estabilidad de GK (i.e., sin que sea capaz de reemplazar funcionalmente al ión K+, en estas condiciones iónicas, Nao/Nai). En este caso el ión K+ desplazado tendría que ser el unido a s1/s2 (dadas las características, conocidas, del bloqueo por TEAo). _x000D_ La prueba de esta hipótesis además de asignar un papel funcional único a s1/s2, contribuirá a determinar la selectividad de este sitio de K+ del poro, con lo que estaremos contribuyendo a determinar la contribución funcional de los distintos sitios de union de K+ del poro de canales de K+ ; _x000D_ o bien:_x000D_ 2. El TEAo no inhibe el colapso de GK en 0 K+ por que en esta condición el TEA no bloquea al poro (como sucede en los canales Kv2.1), y por tanto su efecto facilitador del colapso no se debe a que directamente desplace al ión K+ crítico. Cabe precisar que es claro que en este caso (0 K+): El TEA aunque no se uniera a su sitio de bloqueo, se seguiría uniendo a los canales, ya que acelera la caída de GK en 0K+. El TEA en esta condición se uniría en otro sitio o al mismo sitio pero modificado (e.g., tal vez simplemente mediante el desplazamiento de las cadenas laterales que lo conforman). En otras palabras y relacionado con esta hipótesis tenemos la siguiente:_x000D_ 3. En contraste con el modelo actual de bloqueo de canales de K+ por TEAo, que considera que el sitio de bloqueo esta conservado en todos los Kv (siendo este los 4 residuos de la posición 449 de Shaker), las diferencias observadas sobre el efecto del TEAo en el mantenimiento de la conductancia de los canales Shaker y Shab, se deben a que el sitio de unión del TEAo no es el mismo en ambos canales._x000D_

Contribuciones del Proyecto._x000D_ El presente es un proyecto de ciencia básica. Su contribución consistirá en incrementar nuestro conocimiento de la dinámica y la farmacología del poro de canales de K+ en función de la distribución de K+ a través de la membrana, y particularmente en condiciones de hipokalemia en la que hemos demostrado que la conductancia de los canales se colapsa. _x000D_ El proyecto contribuirá además a la formación de recursos humanos. Una parte de este estudio formará parte de la Tesis de Doctorado de una estudiante del laboratorio. También servirá para completar la formación de un postdoctoral del laboratorio (ver Proyecto)._x000D_ Específicamente en este proyecto contribuiremos a:_x000D_ (1) conocer el mecanismo por el que el ión K+ mantiene estable la GK de canales Kv (determinando si es necesario que todos los sitios de K+ del poro (s1-s4) estén ocupados para que GK sea estable, o si es la ocupación de solo el más extyerno (s17s2) lo que mantiene la estabilidad) _x000D_ (2) el papel de los sitios más externos del filtro de selectividad (s1/s2) tanto en el mantenimiento de la conformación capaz de conducir iones del poro, así como la selectividad de estos sitios externos en relación a la selectividad global del poro (i.e., la determinada con potenciales de inversión). Este punto se completara con otro estudio farmacológico en curso de nuestro laboratorio _x000D_ (3) como varia la farmacología de los canales en condiciones de hipokalemia, que pueden incluso tener interés clínico (ver Discusión de Gomez-Lagunas, 2010 y Robertson, 2009). Esto lo haremos estudiando el bloqueo por TEA externo en función de la distribución de K+ a través de la membrana y su efecto en la estabilidad de GK._x000D_ (4) Adicionalmente, los datos obtenidos en este estudio también servirán para probar nuestra hipótesis (Gomez-Lagunas et al, manuscrito en preparación) de que la inactivación lenta de Shab (y posiblemente de otros canales de K+ como el Kv2.1) no involucra un cierre del lado extracelular del poro (ya que el TEAo acelera la inactivación y sin embrago no impide que se disocie el ion K+ que mantiene estable GK)._x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_