SINTESIS DEL PROYECTO_x000D_ En un estudio previo en el laboratorio en el que se utilizó el procedimiento de absorción de sueros de conejo y de bovinos con antígenos heterólogos, se identificó en el lipopolisacárido (LPS) de cepas de Escherichia coli O157, la presencia de epitopos compartidos entre esta bacteria y los serogrupos de E. coli O7 y O116, así como con las serovariedades Urbana y Arizona de Salmonella [35, 36]. Existen diferentes procedimientos para la detección de sitios inmunodominantes presentes en estructuras de bacterias, virus, proteínas etc. [33], uno de ellos que se ha utilizado con buenos resultados es el método de presentación de péptidos en fagos filamentosos conocido como Phage Display [47]. Con este método se han identificado mimotopos del LPS y de la pared celular de microorganismos como Shigella flexneri 5ª [10, 41]. De Bolle X [14] por su parte, reportó las propiedades antigénicas de mimotopos del LPS obtenidos por phage display, en cepas de Brucella abortus y Gevorkian G [23], identificó que mimotopos de componentes de la pared celular de Mycobacterium tuberculosis, eran reconocidos tanto por un suero obtenido en conejos inmunizados con la pared celular de la bacteria, como por el suero de pacientes con diagnóstico de tuberculosis. _x000D_ Estudios similares realizados con la misma metodología de phage display, se utilizaron para la selección de mimotopos del LPS de Vibrio cholerae O1 Ogawa y de la capsula de V. cholerae O139. Con los péptidos seleccionados se inmunizaron ratones y se observó tanto la producción de anticuerpos contra el LPS, como una respuesta inmune protectora la cual fue evaluada al retar a los animales con la bacteria viva [15, 16, 20]._x000D_ En el laboratorio existe experiencia en el empleo del método de Phage Display, este se utilizó en la identificación de epitopos inmunodominantes en las proteasas de serina Pet y Pic, ambas secretadas por E. coli y S. flexneri [26]. _x000D_ La propuesta del presente proyecto esta dirigida a la selección e identificación del o los mimótopos de los epitopos que previamente reportamos son compartidos entre E. coli O157, las serovariedades de S. Urbana, S. Arizonae y los serogrupos de E. coli O7 y O116 [35, 36]. Al identificar la composición y ubicación de estos epitopos, se puede evaluar su uso como inmunógenos potenciales con capacidad para inducir respuesta inmune protectora contra la colonización intestinal de los patógenos entéricos que comparten dichos epitopos. En el trabajo previo [35], en el que se identificó la presencia de epitopos compartidos entre diferentes enterobacterias, también se evaluó la actividad bactericida del suero policlonal de conejo obtenido contra E. coli O157, E. coli O7 y O116. En este ensayo se utilizaron las cepas homólogas y heterólogas, los resultados mostraron la presencia de anticuerpos bactericidas hecho que sugiere que la respuesta contra componentes del LPS tiene un efecto protector que pudiera interferir con la colonización intestinal de estas bacterias._x000D_ En una primera etapa del proyecto nos proponemos realizar la selección (biopanning) de mimótopos del LPS, esta se realizará con las IgG de sueros policlonales de conejo anti-LPS de E. coli O157 y una biblioteca de péptidos que son expresados en la proteína III del fago filamentoso M13 (Phage Display). Los fagotopos seleccionados (fagos portadores de la secuencia mimética de péptidos), se utilizaran para inmunizar conejos y evaluar si los anticuerpos generados reconocen el LPS de las bacterias en estudio (E. coli O157, O7 y O116 y las serovariedades de S. Urbana, S. Arizonae). Con el resultado en caso de ser positivo, los fagos se reproducirán para obtener el DNA de estos y conocer la secuencia de aminoácidos que corresponde al epitopo inmunodominate. A partir de la o las secuencias de aminoácidos obtenidas, se procederá a solicitar la síntesis de los péptidos correspondientes. _x000D_ Con los péptidos sintéticos se utilizaran para inmunizar conejos y obtener los anticuerpos respectivos para evaluar su inmuno-reactividad contra los LPS de diferentes enterobacterias. En esta fase también se analizará si el suero de conejo obtenido contra los diferentes LPS s reacciona contra los fagotopos seleccionados y los péptidos sintéticos, esto permitirá confirmar que la secuencia peptídica es mimotopo del epitopo que se está analizando._x000D_ Considerando los resultados obtenidos al respecto por otros investigadores [14, 15, 16, 20], se evaluará si los anticuerpos anti-péptidos obtenidos, muestran actividad de tipo protectora que se analizará mediante un ensayo de actividad bactericida. Además con los perfiles electroforéticos del LPS de E. coli O157, S. Urbana, S. Arizonae y los serogrupos de E. coli O7 y O116, se pretende identificar la región del LPS a la que pertenecen los mimotopos seleccionados._x000D_ Con los resultados obtenidos la siguiente fase del proyecto consistirá realizar ensayos in vitro y en modelo animal para demostrar que los anticuerpos anti-mimotopos del LPS O157 tienen la propiedad de neutralizar el efecto endotóxico de los LPS de diferentes enterobacterias. En forma conjunta se desarrollara un modelo animal de ensayos de desafío/protección empleando como inmunógenos los péptidos-mimotopos sintéticos del LPS O157. Los resultados positivos en estos ensayos confirmarán que se cuenta con un inmunógeno polivalente con propiedades inmunogénicas, con el que se podrá desarrollar una vacuna protectora contra enterobacterias de interés médico y epidemiológico._x000D_

CONTRIBUCION DEL PROYECTO EN EL AVANCE DEL CONOCIMIENTO EN SU PROPIA TEMATICA._x000D_ Una alternativa que recientemente ha surgido para el empleo del lipopolisacárido (LPS) como inmunógeno es la utilización de mimotopos del LPS, los cuales pueden ser utilizados en el desarrollo de vacunas contra este tipo de antígenos [32]. El LPS es el principal constituyente de la membrana externa de las bacterias Gram-negativas, entre ellas las enterobacterias. Una célula bacteriana contiene 3.5 X 106 moléculas de LPS, en E. coli aproximadamente el 75% del peso seco lo constituye el LPS mientras que el otro 25% está compuesto por proteínas de membrana externa. El uso de bacterias vivas, atenuadas o el LPS purificado de E. coli como vacunas tienen efectos adversos en el hospedero. En estudios en modelo animal de ratón de la cepas C3H/HeN muestran que la aplicación intragástrica de E. coli O157 viva conduce en los animales a desarrollar síntomas sistémicos, neurológicos y gastrointestinales, además de focos necrosantes en el epitelio intestinal del colón y daño renal agudo [29]. Por otra parte la aplicación LPS en animales al interactuar con receptores de las células de la respuesta inmune, conduce a una serie de padecimientos como fiebre, shock endotóxico e inflamación [27]. En el caso de shock endotóxico, los mediadores de inflamación se producen en exceso, ocasionando inestabilidad hemodinámica, activación de complemento y de la cascada del proceso de coagulación. Los eventos descritos anteriormente son las principales desventajas para utilizar el LPS o parte del mismo como inmunógeno. Por lo que el desarrollo de un inmunógeno libre de LPS y de bacterias vivas y/o atenuadas que pueda utilizarse en la prevención de las infecciones intestinales, es una contribución con impacto no solo al conocimiento en el área de prevención y control de las enfermedades infecciosas intestinales, también lo es en el desarrollo de nuevos inmunógenos de tipo protector para diferentes padecimientos. _x000D_ Por otro lado al obtener péptidos (mimótopos) que inducen la expresión de anticuerpos específicos dirigidos contra una región inmunodominante, se pueden desarrollar reactivos útiles en sistemas para diagnóstico rápido de los microorganismos causantes de infección intestinales. Otra de las contribuciones del Proyecto en la temática del área del conocimiento es la posibilidad de obtener anticuerpos anti-péptidos que pudieran presentar la capacidad de neutralizar el efecto endotóxico del LPS de diferentes enterobacterias en modelo animal._x000D_ _x000D_ JUSTIFICACIÓN DEL PROYECTO_x000D_ Hasta el momento se carece de un sistema de protección contra la colonización por bacterias causantes de enfermedad intestinal. Aunque existen una serie de estudios que reportan el empleo del LPS o de bacterias atenuadas como vacuna para la protección contra la colonización intestinal por E. coli O157, su empleo como vacunas no han sido concluyentes. Viret J F, [52], mostró que la inmunización de individuos adultos con vacunas de Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi y de V. cholerae atenuadas, inducen la formación de anticuerpos que interfieren con la capacidad de las bacterias para colonizar el intestino y que además tienen actividad bactericida contra ambas bacterias. Sin embargo, también observó que la protección de estos adultos inmunizados era limitada a 14 meses. _x000D_ Por otro lado un estudio en un modelo con ratones BALB/c inoculados oralmente con dos dosis de la cepa de S. enterica subsp. enterica serovar Landau, la cual comparte epitopos con el LPS de E. coli O157 [12], mostró la presencia de anticuerpos en suero y en heces a títulos altos contra el LPS de E. coli O157. Posteriormente estos mismos animales fueron retados oralmente con una cepa de E. coli O157:H7, los resultados señalan resistencia a la colonización intestinal por E. coli O157 mayor que la observada en los ratones que no fueron previamente inmunizados. Resultados similares se obtuvieron al inocular ratones BALB/c con dos dosis de E. coli O157:H7, en este se observó reducción en la excreción de la bacteria después aplicar un segundo inóculo [11]. _x000D_ Estudios preliminares en nuestro laboratorio muestran la presencia de epitopos compartidos entre dos géneros de enterobacterias, E. coli y Salmonella [35]. Ambos grupos de enterobacterias representan dos de los principales agentes etiológicos de infecciones intestinales en niños menores de cinco años. La identificación y obtención de mimotopos de epitopos comunes de estos dos géneros de enterobacterias permitirá el desarrollo de una vacuna polivalente libre de bacterias y sin los efectos endotóxicos del LPS._x000D_