Aunque la función más conocida de la mitocondria es la síntesis de ATP acoplada al transporte de electrones a través de la cadena respiratoria, sabemos que dicho organelo participa de manera importante en otros procesos como la señalización por Ca2+ y la producción de especies reactivas de oxígeno (EROs). En el espermatozoide la presencia de Ca2+ es esencial para llevar a cabo dos procesos fundamentales, la movilidad y la reacción acrosomal (requisito indispensable para que el espermatozoide pueda fecundar al óvulo homólogo). El erizo de mar posee una sola mitocondria situada en la base de la cabeza en la cual se sintetiza el ATP necesario para que las dineinas (ATPasas presentes en el axonema-aparato motor del flagelo) mantengan el movimiento flagelar. En nuestro grupo con el afán de empezar a entender la participación de la mitocondria en la regulación de la concentración del Ca2+ intracelular ([Ca2+]i) en la fisiología del espermatozoide, se utilizaron espermatozoides de erizo de mar en suspensión o células individuales cargadas con indicadores fluorescentes sensibles a Ca2+ (fluo-4 o fura-2) y diferentes agentes (CCCP, antimicina, CGP37157, u oligomicina) que afectan la función mitocondrial (Ardón et al., 2008 enviado). Lo que se observó fue un aumento en la [Ca2+]i dependiente de la presencia de Ca2+ extracelular, y que la vía de permeabilidad abierta por los inhibidores deja pasar Mn2+ cuya entrada se bloquea por Ni2+. Además, el hecho de que el SKF96365 y el Gd3+ (bloqueadores de la entrada de Ca2+ capacitativa y de canales TRP, respectivamente, inhiban la entrada de Ca2+, sugiere la participación de canales tipo SOC (operados por pozas internas) regulados por el estado funcional de la mitocondria. En un intento por identificar la naturaleza y la localización de los cambios en la concentración de Ca2+ intracelular [(Ca2+]i) inducidos por los inhibidores mitocondriales, se hicieron también experimentos similares en espermatozoides individuales, desgraciadamente la resolución espaciotemporal del sistema no permitió detectar disminuciones en la [Ca2+] en la región de la mitocondria. Ahora en este proyecto nos proponemos utilizar colorantes fluorescentes que marquen específicamente la mitocondria para poder seguir los cambios en las concentraciones de Ca2+ ([Ca2+]mit), de las especies reactivas de oxigeno (EROs) y en el potencial (Emit) mitocondriales. Esto lo analizaremos tanto en respuesta al speract (decapéptido de la cubierta externa del óvulo homólogo que regula la movilidad del espermatozoide) como a inhibidores mitocondriales. Además con la idea de identificar las entidades moleculares y la localización de las moléculas participantes en la comunicación mediada por Ca2+ entre la mitocondria y la membrana plasmática que está en íntima relación con dicho organelo, utilizaremos estrategias de inmunolocalización, de microscopia electrónica y de ¨smart patch¨. Esta última es una técnica que combina la del ¨patch clamp¨ (registro de canales iónicos en parches de membrana) con la microscopia de barrido de conductancia de iones, y que nos permite registrar y conocer la localización exacta de un canal funcional en la membrana de un espermatozoide vivo.

El control de la producción de ATP por el aumento de la [Ca2+]mit es un mecanismo importante que utiliza la célula para satisfacer el requerimiento de energía. En células con cilios o flagelos, la mitocondria juega un papel muy relevante en la regulación de la movilidad al aumentar la producción de ATP, sustrato de la enzima dineína que se encuentra asociada al axonema (aparato motor del flagelo). Lo anterior se vuelve crucial si se piensa en células como el espermatozoide de organismos marinos como el erizo de mar, que poseen solo una mitocondria en la base del flagelo; y es éste organelo, el que proporciona el ATP necesario para que el espermatozoide llegue a la superficie del óvulo y pueda fecundarlo. Algo parecido sucede en el caso de los mamíferos, donde las mitocondrias se encuentran formando una capa que rodea a la fibra densa externa y al axonema en la pieza media del flagelo. Sin embargo en este caso hay otras fuentes de energía. Lo anterior hace del espermatozoide del erizo de mar un modelo excepcional para el estudio de la relación entre la [Ca2+]mit y la movilidad. El erizo de mar, es un organismo deuterostomado (antecesor de vertebrados) de fecundación externa que produce enormes cantidades de gametos. De un erizo macho se obtienen ~1010 espermatozoides y de la hembra ~108 óvulos. Lo anterior permite aislar componentes membranales involucrados en el diálogo entre los gametos. El genoma de S. purpuratus se conoce y es sólo un cuarto del de humano, además morfológicamente los espermatozoides de erizo son más sencillos que los de mamífero. Se han descubierto nuevas vías de señalización generales estudiando al espermatozoide del erizo. Además estas células son un modelo excelente para estudiar la movilidad debido a que el espermatozoide nada en un plano en círculos de ~50 µm de diámetro/segundo cerca de la superficie de un portaobjetos por periodos largos. Lo anterior permite visualizar al espermatozoide nadando durante un tiempo considerable (segundos) sin que se salga del campo del microscopio. En este proyecto nos proponemos utilizar estrategias de frontera como el registro de los cambios en la [Ca2+]i y del potencial mitocondrial (Emit) del espermatozoide vivo a nivel de célula única mediante indicadores fluorescentes. Además otro de nuestros objetivos es, identificar las moléculas que participan en la comunicación mediada por Ca2+, entre la mitocondria y la membrana plasmática que cubre dicho organelo. Para esto utilizaremos las técnicas de inmunocitoquímica, de microscopía electrónica y la técnica de ´smart patch´, capaz de registrar canales funcionales en la membrana del espermatozoide vivo que está cubriendo la mitocondria. Finalmente nos proponemos contestar si el estado de la mitocondria altera la respuesta del espermatozoide del erizo de mar al speract (decapéptido de la cubierta externa del óvulo homólogo que regula su permeabilidad y su forma de nadar). Utilizando los inhibidores mitocondriales determinaremos como se modifican tanto los cambios en el [Ca2+]i como la forma de nadar del espermatozoide en respuesta al speract.