La isoenzima fotosintética de la fosfoenolpiruvato carboxilasa (PEPC) de hojas de plantas con metabolismo C4 (PEPC-C4) cataliza la primera carboxilación de un compuesto orgánico, fosfoenolpiruvato (PEP), en la ruta de asimilación del CO2 atmosférico en este tipo de plantas, que son de alta productividad y poseen un uso muy eficiente del agua. La actividad de la enzima está altamente regulada por efectores alostéricos (activadores e inhibidores) y por modificación covalente reversible (fosforilación-desfosforilación de una serina), la que a su vez modula la acción de los efectores alostéricos. La compleja regulación alostérica de esta enzima y su indudable interés biotecnológico, la convierten en un interesante objeto de estudio. En mi grupo de investigación hemos realizado en el pasado estudios cinéticos detallados encaminados a entender la regulación integrada de la actividad de la PEPC, es decir la forma en que interactúan los diferentes factores involucrados en esta regulación. Nuestros principales hallazgos han sido: 1) El verdadero sustrato de la reacción es el complejo PEP-Mg. 2) El PEP libre es un activador que se une al mismo sitio alostérico que los azúcares fosforilados, como glucosa-6-fosfato y triosas fosfato. 3) Los efectos de estos activadores son sinérgicos con los de otro tipo de activadores alostéricos, los aminoácidos neutros glicina o alanina. 4) Los efectos de los inhibidores alostéricos, como malato, no pueden ser contrarrestados por los azúcares fosforilados, pero sí por glicina o alanina. Estos resultados indicaron que la regulación alostérica de la PEPC-C4 no involucra sólo dos estados conformacionales (T y R de acuerdo al modelo concertado de Monod-Wymann-Changeux) como se había propuesto, sino que adopta varios estados conformacionales, los cuales son inducidos o estabilizados por sus efectores alostéricos, ya sea solos o en combinación. En el proyecto que ahora proponemos, pretendemos abordar estudios para entender las bases estructurales de esta compleja regulación alostérica, lo que facilitará la futura manipulación de la enzima con fines biotecnológicos. Estos estudios involucrarán: 1) Obtención y caracterización de proteínas recombinantes y mutagénesis sitio dirigida de estas enzimas, usando herramientas de biología molecular y las clásicas de enzimología, como las de cinética enzimática y purificación de proteínas. 2) Detección y caracterización fisicoquímica y estructural de los diferentes estados conformacionales. Para ello se usarán métodos espectroscópicos (tales como fluorescencia intrínseca de la proteína y extrínseca de fluoróforos como el ANS, así como dicroismo circular en la región UV cercana y lejana), métodos calorimétricos (calorimetría diferencial de barrido), proteolisis limitada e identificación de los péptidos resultantes por espectrometría de masas, y finalmente cristalografía y difracción con rayos X. 3) Caracterización funcional de los estados conformacionales, usando estudios de velocidad inicial en estado estacionario y determinando la unión de los ligandos alostéricos al equilibrio y la cinética de su unión por medio de la técnica de flujo detenido. 4) Análisis de la filogenia de las PEPC-C4 y de co-evolución de residuos de aminoácidos relevantes para la regulación alostérica, con el fin de entender el mecanismo de transmisión de las diferentes señales alostéricas. Los resultados que obtengamos contribuirán al entendimiento de los mecanismos de regulación alostérica de esta enzima clave en la productividad de las plantas. Además, dada la gran complejidad de la regulación alostérica de esta enzima, que la hace muy especial si no única entre las enzimas alostéricas hasta ahora estudiadas, este proyecto es de gran relevancia en la enzimología, ya que permitirá avanzar en la comprensión de los mecanismos y de las bases estructurales de la regulación alostérica, un fenómeno que es de importancia crucial en los procesos biológicos.

Dada la complejidad de su regulación, que la hace única entre las enzimas alostéricas, el estudio de la ZmPEPC-C4 ofrece un gran reto dentro del campo de la regulación alostérica. Los resultados mencionados en Antecedentes sugieren particularidades muy interesantes en su regulación, que la hacen diferente de otras enzimas alostéricas, pero que aún no se pueden integrar de forma concluyente en un mecanismo de regulación. Con el presente proyecto pretendemos detectar y caracterizar estructuralmente los estados conformacionales de la C4ZmPEPC, de manera que se pueda establecer el mecanismo de regulación alostérica de esta importante y sumamente compleja enzima. Aunque esta enzima ya ha sido objeto de intensa investigación, no siempre muy rigurosa, aún no se conocen aspectos muy importantes de su mecanismo de regulación. Muchos de los estudios que estamos proponiendo llevar a cabo son novedosos en el sentido de que no se han realizado antes con ninguna PEPC. Otros si se han hecho, pero abordaremos aspectos no estudiados hasta ahora. Los resultados que obtengamos serán una importante contribución al conocimiento de la alostería en general, un fenómeno central en la Biología. _x000D_ Por otra parte, la relevancia de la isoforma fotosintética de la PEPC de plantas C4 en la productividad de estas plantas ha llevado a varios investigadores a usar el gen que la codifica en experimentos de ingeniería genética, tratando de crear características C4 en plantas C3 (Miyao y Fukayama, 2003), sin éxito hasta el momento. Éste es un reto muy difícil porque son muchos los genes involucrados en la ruta C4, pero indudablemente uno de los factores que está limitando el éxito de estos experimentos es que no se conocen aún a fondo las propiedades de las enzimas involucradas en esta ruta, en particular las de la isoenzima PEPC-C4. El estudio de las características de la regulación de esta enzima no sólo podría facilitar en un futuro la manipulación de su actividad usando como herramientas posibles efectores, sino que es de suma importancia para predecir los alcances de otro tipo de alteración de su actividad, como sería la sobre-expresión de la enzima en hojas. Por ello, los estudios propuestos permitirán a futuro explorar la posible activación de la enzima por la aplicación de compuestos exógenos o alteración de condiciones ambientales y además establecerán las bases para una futura manipulación racional de su actividad por métodos de ingeniería genética. Así, un mayor conocimiento del mecanismo de regulación alostérica de esta enzima permitiría optimizar la producción agrícola, fundamental para la alimentación humana._x000D_ Con los resultados obtenidos esperamos que se gradúen dos estudiantes de doctorado, uno de maestría, y uno de licenciatura y que se publiquen al menos tres artículos en revistas internacionales de prestigio con arbitraje estricto. Estos resultados serán presentados para su difusión y discusión directa con las comunidades científicas nacional e internacional._x000D_