PAPEL DEL PÉPTIDO VSFPSCCFSIAVIFM Y SU SINERGIA CON LA PROTEÍNA DEL CEMENTO1 (CEMP1) DURANTE EL PROCESO DE MINERALIZACIÓN IN VITRO E IN VIVO_x000D_ SÍNTESIS_x000D_ Las alternativas actuales para el desarrollo de terapias regenerativas han sido influenciadas por nuestro entendimiento del desarrollo embrionario, la biología de células troncales y la tecnología de ingeniería de tejidos. La ingeniería de tejidos ha emergido entonces como un medio potencial para regenerar o crecer tejidos funcionales a través del uso de de mediadores biológicos y matrices para el reemplazo de aquellos que se han perdido debido a trauma y/o enfermedad y/o afectados por el envejecimiento (Ikeda et al., 2009; Atala, 2005; Griffith LG y Naughton G, 2002; Purnell B, 2008). La regeneración tisular se lleva a cabo a través de la recapitulación de eventos clave que ocurren durante la formación y crecimiento tisular que incluyen; migración celular, proliferación/apoptosis, diferenciación, interacciones inductivas/inhibitorias y morfogénesis tisular. Moléculas señalizadoras, células y andamios son entonces necesarios para la regeneración tisular para reproducir esta secuencia o eventos del desarrollo (Bell E., 2000). El tratamiento de defectos óseos asociado con la no-unión de fracturas y la morbilidad ósea como resultado de trauma o cáncer es un reto de gran importancia en la medicina ortopédica, la odontología y cirugía plástica. Por lo tanto, la regeneración de las estructuras óseas, bucales, craneofaciales y de otros tejidos mineralizados representa un reto formidable que requiere de la síntesis de la ciencia básica, clínica y tecnología para la ingeniería de tejidos. Estas alternativas terapéuticas se enfocan en la liberación de factores de crecimiento osteoinductivos, utilizando la liberación directa de proteína o alternativas de terapia génica, la implantación de células osteogénicas o la combinación de estas para promover la regeneración ósea (Nussenbaum y Krebsbach. 2006). Las opciones terapéuticas utilizando terapia génica para liberar moléculas en los defectos óseos incluyen la modificación génica ex vivo de células que son subsecuentemente transplantadas, la inyección de vectores virales conteniendo moléculas bioactivas y otra alternativa basada en plásmidos de ADN (Huang YC, et al., 2005). En años recientes se han desarrollado diversos materiales para la liberación controlada de proteínas humanas recombinantes, como las proteínas morfogénicas de hueso en fórmulas basadas en la colágena como material acarreador o andamio. Sólo las proteínas recombinantes humanas BMP-2 y BMP-7/OP1 han obtenido la aprobación para su uso clínico en humanos por la FDA (USA), y ésta se limita únicamente a aplicaciones ortopédicas y de fusión de la columna vertebral. De gran importancia en el campo de la Odontología es la enfermedad periodontal, la cual es una enfermedad inflamatoria crónica infecciosa y que eventualmente destruye las estructuras de soporte de los órganos dentarios (Burt, 1993), y constituye un problema de salud pública a nivel mundial (Barmes, 2000). En nuestro laboratorio recientemente aislamos, una proteína a partir del medio condicionante de células derivadas de un cementoblastoma humano y la hemos denominado proteína del cemento1 (CEMP1). Esta fue aislada utilizando el anticuerpo policlonal anti-CEMP1, producido en conejo, En las bases de datos utilizando el banco NCBI BLAST no presenta homología a alguna otra proteína. Sin embargo, entre los aminoácidos 30 al 110 presenta 48% de similitud con colágena alfa I cadena (I), 46% con colágena XI y 40% con colágena X. Se produjo la proteína recombinante CEMP1 y un anticuerpo policlonal contra esta. Nuestros resultados demostraron que es expresada en subpoblaciones celulares del ligamento periodontal humano, cementoblastos bordeando el cemento radicular, células progenitoras de posición paravascular en el ligamento periodontal y pericitos en el hueso alveolar así como en cartílago de la médula espinal y de extremidades superiores e inferiores durante el desarrollo (Alvarez-Pérez et al 2006)._x000D_ _x000D_ Estudios previos in vitro demuestran que la proteína recombinante del cemento 1 (CEMP1) promueve la diferenciación de células no esqueléticas hacia un fenotipo mineralizante (Carmona et al., 2007). Asimismo, esta proteína ha mostrado poseer una alta afinidad a hidroxiapatita y más importante aún, participa en el proceso de mineralización promoviendo la nucleación de cristales de fosfato octacálcico (Villarreal-Ramírez et al., 2009). La necesidad de moléculas que promuevan la regeneración, ósea, cemento, ligamento periodontal y cartílago es ampliamente reconocida. El problema a resolver radica también en proponer una formulación capaz de promover y/o estimular la formación de hueso, sin que este crecimiento resulte incontrolable y/o ectópico, para su uso en la regeneración ósea, y que sea capaz asimismo, de replicar los procesos fisiológicos normales para la formación de cemento, ligamento periodontal y hueso. Esta nueva alternativa terapéutica no deberá inducir la calcificación arterial o incrementar el riesgo para el desarrollo de neoplasias. Las evidencias experimentales obtenidas a la fecha indican que la proteína del cemento 1 (CEMP1) constituyente natural del cemento radicular y que no se ha determinado su expresión en otros tejidos adultos, posee las propiedades biológicas indicadas para llevar a cabo la regeneración ósea, de ligamento periodontal, cemento y hueso._x000D_ El gen que codifica para la proteína de adhesión del cemento radicular (CAP/PTPLA) ha sido aislado y caracterizado en nuestro laboratorio. Contiene un cDNA de 1435bp (Número de acceso GenBank AAR22554; GI:38503520; HGNC ID: 9639) y cuyo marco de lectura abierto codifica para una proteína de 140 aminoácidos, con un peso teórico de 14920 daltones, no presenta péptido señal ni N-glicosilaciones y presenta sitios de fosforilación in silico. El gen CAP/PTPLA está localizado en el cromosoma humano 10p14-p13. La proteína de adhesión del cemento radicular humano es un splicing alternativo de la PTPLA y sinónimo de esta por lo cual las siglas CAP/PTPLA. PTPLA contiene 7 exones, mientras CAP contiene únicamente los exones 1 y 3. Los miembros de la familia de la proteína tirosina fosfatasa (PTF) son moléculas señalizadoras que regulan una variedad de procesos celulares. En nuestro laboratorio hemos producido la proteína recombinante humana CAP/PTPLA en un sistema procarionte (E. coli). Esta proteína promueve la proliferación de células derivadas del ligamento periodontal humano in vitro y la actividad específica de la fosfatasa alcalina (ver resultados preliminares). La CAP/PTPLA codifica para un producto de 140 aminoácidos y el splicing alternativo ocurre exactamente en el sitio de actividad de la PTPLA, por lo que inferimos su función podría ser diferente. Este splicing alternativo comprende los últimos 15 aminoácidos de la secuencia de la proteína (VSFPSCCFSIAVIFM). Esta secuencia es única en las bases de datos. Más importante aun, el péptido que ha sido sintetizado ha demostrado poseer propiedades únicas de utilidad biológica ya que posee alta afinidad por la hidroxiapatita y asimismo, promueve la formación de cristales de hidroxiapatita in vitro. Ensayos de hibridación in situ utilizando una sonda que contiene 45 bp (los últimos 15 aminoácidos), indica que esta secuencia es tejido-específica, ya que es expresada por cementoblastos y células troncales del ligamento periodontal. El anticuerpo policlonal producido contra este péptido indica que esta secuencia es expresada por cementoblastos y células troncales mesenquimales del ligamento periodontal y no en otros tejidos. Estos hallazgos en conjunto revelan que esta secuencia peptídica del gen CAP/PTPLA podría participar en el proceso de diferenciación celular y promover el proceso de biomineralización invitro. Una vez establecido que la proteína del cemento 1 (CEMP1) y el péptido VSFPSCCFSIAVIFM, ambos, cemento-específicos, participan en el proceso de mineralización in vitro, planteamos en este proyecto el determinar las propiedades biológicas de CEMP1 y el péptido sintético VSFPSCCFSIAVIFM actuando sinergísticamente en

CONTRIBUCIÓN DEL PROYECTO_x000D_ Nuestras investigaciones se han enfocado al estudio de los mecanismos celulares y moleculares que regulan la formación del cemento radicular in vitro. Hemos aislado 2 genes que codifican para CEMP1 y CAP/PTPLA. Hemos caracterizado ambos genes y su productos y más importante, hemos determinado que una secuencia específica de la proteína CAP/PTPLA posee propiedades reguladoras en el proceso de biomineralización. Esto nos permitirá entender en el futuro mediato de un modo específico los mecanismos celulares y moleculares regulados por estos factores durante el proceso de biomineralización. En base a las propiedades biológicas que poseen CEMP1 y el péptido VSFPSCCFSIAVIFM, esta contribución original adicionará conocimiento en el área de la biología de los tejidos mineralizados y permitiría el diseño de terapéuticas predecibles para la regeneración de tejidos mineralizados._x000D_ Diversas estrategias experimentales proveen oportunidades novedosas para determinar el papel específico CEMP1 y el péptido VSFPSCCFSIAVIFM en el proceso de la osteogénesis, cementogénesis y de de otros tejidos mineralizados, así como en la regeneración de tejidos mineralizados y de un modo importante en la regeneración de las estructuras del periodonto. La producción de proteínas recombinantes en sistemas procariontes y eucariontes y la síntesis del péptido VSFPSCCFSIAVIFM son herramientas excelentes para determinar las propiedades biológicas (particularmente aquellas relacionadas a la inducción y o regeneración de tejidos mineralizados) y que establecerá de un modo definitivo en estudios in vitro y en estudios preclínicos in vivo sus propiedades biológicas funcionales. Nuestros datos preliminares, sugieren que la CEMP1 y el péptido VSFPSCCFSIAVIFM son factores noveles importantes en el proceso de biomineralización y de potencial utilidad terapéutica en la regeneración de los tejidos mineralizados que se han perdido debido a defectos congénitos, cáncer y enfermedades que afectan estas estructuras. _x000D_ Se determinarán los efectos de CEMP1 y el péptido VSFPSCCFSIAVIFM actuando sinergísticamente en la diferenciación celular in vitro. Las propiedades funcionales serán determinadas utilizando cultivo celular, proteínas recombinantes, péptidos sintéticos, FACS y estudios preclínicos in vivo. Las estrategias planteadas en este proyecto adicionarán conocimiento sobre el papel preciso de CEMP1 y el péptido VSFPSCCFSIAVIFM durante los procesos de diferenciación e inducción de la formación de novo de tejidos mineralizados in vitro e in vivo. El plan experimental planteado en este proyecto, proveerá los datos necesarios para probar nuestra hipótesis de que CEMP1 y el péptido VSFPSCCFSIAVIFM desempeñan un papel clave en la diferenciación celular hacia un fenotipo “mineralizante” y en la subsiguiente mineralización de la matriz extracelular para formar tejidos mineralizados in vitro como in vivo._x000D_ METAS EN LA FORMACIÓN DE DOCTORES Y MAESTROS_x000D_ Una de las metas sustantivas de este proyecto es la formación de recursos humanos de alto nivel. En este proyecto está asegurada la participación de 2 alumnos de Doctorado y 3 alumnos de maestría. Cada uno de los cuales será responsable de una parte del proyecto a través de sus trabajos de tesis._x000D_