La degradación regulada de proteínas por el sistema ubicuitina/proteasoma (SUP) es un mecanismo empleado por los organismos eucariontes para regular un a gran variedad de procesos de desarrollo y de respuesta a condiciones medioambientales. Este proceso ocurre en dos pasos, inicialmente la proteína a ser degradada es modificada mediante la adición de al menos cuatro moléculas de una proteína de 76 aminoácidos denominada ubicuitina. La adición de esta última requiere de su activación y del reconocimiento de la proteína que será degradada, dicho reconocimiento es mediado por una ligasa de ubicuitina. Después de que la proteína ha sido ubicuitinada, ésta es reconocida y degradada por el proteasoma 26S, éste es un complejo de proteínas que está formado de un subcomplejo catalítico (20S) y otro regulatorio (19S). La regulación del SUP requiere de la interacción de los distintos complejos con otras proteínas, esto ocurre tanto a nivel del proceso de ubicuitinación como a nivel del de degradación. _x000D_ En nuestro grupo hemos caracterizado una proteína con caja F de Arabidopsis thaliana, denominada AtFBS1, la cual es parte del complejo de ligasa de ubicuitina SCF. El mensajero de esta proteína se acumula en diversas situaciones de estrés en plantas de Arabidopsis. En la búsqueda de los posibles sustratos de AtFBS1, encontramos que esta proteína interactúa con proteínas 14-3-3. Con base en nuestros resultados, nosotros hipotetizamos que la interacción de AtFBS1 con las proteínas 14-3-3 regula de alguna manera el proceso de ubicuitinación de la proteína sustrato de AtFBS1 y quizás del de esta última también, ya que la inhibición de la interacción entre estas proteínas incrementa la vida media de AtFBS1._x000D_ De acuerdo a lo anterior, en este proyecto pretendemos buscar proteínas que sean capaces de interactuar con AtFBS1 y también de proteínas que interactúen con el proteasoma, en ambos casos en plantas crecidas en condiciones de estrés osmótico, salino o infectadas por patógenos. El objetivo inmediato de esta búsqueda es la identificación de proteínas que debido a su capacidad de regular el SUP en situaciones de estrés, ayuden a la planta a contender con condiciones adversas. La posible función de estas proteínas será analizada en plantas mutantes en los genes correspondientes._x000D_

Como se ha mencionado ya el sistema ubicuitina/proteasoma (SUP) es una pieza importante de la maquinaria de regulación de múltiples procesos en los organismos eucariontes. En las plantas en particular, esta vía parece tener una gran importancia ya que del genoma de Arabidopsis thaliana aproximadamente el 5% codifica para proteínas que participan de alguna manera en el SUP._x000D_ En nuestro grupo nos hemos interesado de un tiempo a la fecha en el papel del SUP en la regulación de los procesos que le permiten a las plantas contender con situaciones adversas. Nuestro estudio se inició con la caracterización de la proteína AtFBS1 la cual es componente de un complejo de ligasa de ubicuitina del tipo SCF, y que con base en el patrón de acumulación de su mensajero, hemos postulado que participa en las respuestas de Arabidopsis a varios tipos de estrés como el osmótico, la salinidad, la herida y la infección por patógenos. Ahora quisiéramos extender nuestro conocimiento acerca del papel que desempeña el SUP en la respuesta de defensa de la planta ante situaciones de agobio, a través de la identificación de nuevos factores que modulen su actividad. Este proyecto esta dividido en dos partes claramente relacionadas._x000D_ En la primera parte del proyecto continuaremos el estudio de AtFBS1 buscando los posibles blancos de su acción. Nosotros suponemos que el blanco o blancos de esta proteína deben de ser reguladores negativos del sistema de respuesta al estrés en Arabidopsis. En la segunda parte de este proyecto, nos proponemos identificar proteínas cuya asociación al proteasoma ocurra bajo condiciones de estrés, estas proteínas deberían de ser o bien sustratos del SUP o bien proteínas que modulen la actividad o la especificidad del proteasoma en estas condiciones. En ambos casos estaríamos identificando proteínas cuya función estaría involucrada en la defensa de las plantas ante medios ambientes desfavorables. Esto evidentemente sería una contribución al conocimiento de los mecanismos que emplean las plantas para contender con situaciones de estrés._x000D_ La idea de este proyecto no es sólo producir una lista de nuevos elementos que se asocian al SUP en condiciones de estrés (¡que en sí sería una aportación novedosa y hasta ahora no intentada!) sino también entender el papel de los nuevos elementos que se detecten mediante el análisis sistemático de las muestras. El estudio de la regulación de las PAPs, la localización intracelular de la misma, así como el estudio del fenotipo que resulte de la deleción y de la sobreexpresión de las nuevas PAPs, nos ayudará a entender el papel fisiológico del nuevo componente. _x000D_ Muchas de las PAPs hasta ahora descritas pertenecen a grupos de función ciertamente divergentes, la función conocida de algunas de ellas, en el marco de la degradación de las proteínas mediada por el sistema de la ubiquitina-proteasoma, esta aún muy lejos de ser entendida. Una posibilidad es que el o los diferentes elementos que interaccionan con una PAP específica, además del proteasoma por supuesto, no han sido aun descritos. La producción de mapas de interacción proteína-proteína que interrelacionen las diferentes PAPs con otros componentes y sistemas celulares es el objetivo máximo de este proyecto._x000D_ Una estrategia ampliamente usada para producir los mapas de interacción proteína-proteína, además del sistema de doble híbrido en la levadura, es el uso de proteínas “etiquetadas” (tagging approach) que permite usar una proteína relevante como “carnada” (Ho et al., 2005). Mediante la purificación por inmunoafinidad del complejo PAP-proteína que interacciona con la PAP, en combinación con las técnicas de caracterización molecular arriba mencionadas, podremos identificar directamente complejos proteicos a escala proteómica (Ho et al., 2005). Validaremos la interacción de las proteínas por medio de inmunoprecipitaciones recíprocas y la co-expresión de las proteínas involucradas e inmunoprecipitación. _x000D_ La diversidad en las conformaciones del proteasoma y de su composición es un campo de investigación que apenas comienza. El estudio de las PAPs, sin duda abrirá nuevas perspectivas sobre la dinámica del proteasoma._x000D_ Otra de las contribuciones que esperamos para este proyecto es la formación de recursos humanos. En el momento presente dos estudiantes de Doctorado, María Teresa Maldonado Calderón y Edgar Baldemar Sepúlveda García, y que han participado de manera muy activa en esta línea de investigación, están iniciando con la escritura de su tesis, por lo mismo ya no han sido incluidos en esta propuesta, sin embargo, esperamos que pronto se incorporen nuevos estudiantes que puedan contribuir a este proyecto.