La bacteria gram positiva Bacillus subtilis es un habitante común del suelo, tiene la capacidad de diferenciarse en endoesporas, permitiéndole sobrevivir en condiciones ambientales extremas. Este organismo no es patógeno y se distingue por su capacidad de excreción de proteínas y la facilidad para cultivarlo a gran escala. Debido a estas características, B. subtilis es utilizado industrialmente para la producción de enzimas y metabolitos de interés comercial. Aun y cuando este organismo ha sido utilizado ya por muchos años en la industria, existen aspectos de su fisiología que han sido poco estudiados. En este sentido, nuestro grupo tiene el interés en estudiar el efecto de modificaciones a la capacidad de transporte de glucosa sobre diferentes aspectos de la fisiología de esta bacteria. Recientemente, en nuestro grupo se ha generado una cepa mutante de B. subtilis que carece de la actividad del sistema de fosfotransferasa (PTS), el cual constituye el principal transportador de la glucosa y otros azúcares. A partir de esta cepa que consume muy lentamente la glucosa (fenotipo PTS- glucosa-), se obtuvieron mediante un proceso de selección en cultivo, varias mutantes que recuperaron parcialmente la capacidad de asimilar glucosa (fenotipo PTS- glucosa+). La caracterización inicial de algunas de estas cepas ha revelado que poseen propiedades con potencial para aplicaciones biotecnológicas, entre ellas: una menor tasa de producción de ácidos orgánicos y la reducción en la represión catabólica por glucosa. En este proyecto se propone llevar a cabo la caracterización fina de la cepa silvestre PTS+, la mutante PTS- glucosa- y un grupo de diez mutantes PTS- glucosa+, así como la modificación de algunas de ellas para convertirlas en cepas con potencial aplicación industrial. Con el propósito de lograr determinar la diversidad metabólica generada durante el proceso de selección, se realizará un estudio de análisis de flujos empleando glucosa marcada con 13C. Esto permitirá establecer la distribución de flujos de carbono a nivel del metabolismo central. Por otro lado, se realizarán cultivos empleando glucosa o mezclas de azúcares (glucosa + xilosa + arabinosa) como fuentes de carbono, en los cuales se determinará la velocidad de crecimiento, el patrón de consumo de azúcares, así como la tasa de producción de ácidos orgánicos. Con base en los resultados de los estudios anteriores, se elegirá a la cepa que muestre la mayor tasa de crecimiento y de consumo de mezclas de azúcares y ésta será modificada para convertirla en productora de etanol. Por otro lado, se elegirá a la cepa que muestre la mejor tasa de crecimiento en glucosa y la menor tasa de producción de ácidos orgánicos, y se le modificará para que exprese el gene que codifica para la enzima ß-galactosidasa a partir de un promotor fuerte. Las cepas generadas serán evaluadas en su capacidad de producción de etanol o ß-galactosidasa y comparadas con cepas isogénicas que posean el PTS activo. Los resultados que se obtengan durante el desarrollo de este proyecto contribuirán a mejorar nuestra comprensión del papel de PTS en la fisiología de B. subtilis y su potencial aplicación al desarrollo y mejoramiento de cepas de producción industrial.

Bacillus subtilis es considerada el modelo mejor conocido de una bacteria gram positiva, sin embargo, aún existen aspectos de su fisiología que han sido poco estudiados. En particular, se conoce poco acerca de los efectos de modificaciones al sistema de fosfotranferasa (PTS). Este es un sistema proteico complejo que cumple con varias funciones muy importantes para la célula, que incluyen el transporte de azúcares, la conversión del intermediario glicolítico fosfoenolpíruvato en piruvato y el fenómeno de represión catabólica, entre otros. En este proyecto se plantea estudiar los efectos de la inactivación de PTS sobre la distribución de flujos en el metabolismo central de carbono, la capacidad de síntesis de ácidos orgánicos y la represión catabólica por glucosa. El análisis de flujos empleando glucosa marcada con 13C no ha sido reportado en cepas PTS- de B. subtilis, por lo tanto, esta será una contribución importante en el campo. Por otro lado, nuestro grupo cuenta con un grupo de mutantes que carecen de PTS, pero que han recuperado la capacidad de consumir glucosa (fenotipo PTS- glucosa+). Este tipo de mutantes no ha sido reportado para B. subtilis, y su utilidad radica en que permitirán estudiar el grado de represión catabólica ejercido por la glucosa en un fondo genético PTS-. Por otro lado, B. subtilis es un microorganismo importante económicamente, ya que ha sido utilizada desde hace muchos años para la producción industrial de proteínas y metabolitos. Algunos de los efectos esperados por la inactivación de PTS, como lo son la reducción en la tasa de síntesis de ácidos orgánicos y la disminución en la represión catabólica, son características que pueden mejorar las propiedades de una cepa para la producción de proteínas recombinantes o biocombustibles. Una de las aportaciones del desarrollo de este proyecto consistirá en establecer si existen ventajas al utilizar el fenotipo PTS- en cepas de producción de B. subtilis.