Los canales de calcio dependientes del voltaje tienen un papel importante en la fisiología de las células excitables al ser la fuente del calcio para la generación de la señal que desencadena las respuestas celulares, tales como la contracción muscular, la liberación de neurotransmisores y los potenciales de acción. Este último fenómeno puede ser el resultado directo de la entrada del calcio a través de esos canales o por la despolarización de la membrana plasmática hasta alcanzar el umbral de los canales de sodio dependientes del voltaje. Recientemente se ha descrito la participación de los canales de calcio dependientes del voltaje de bajo umbral tipo T en la fisiopatología de algunas enfermedades como la epilepsia de ausencia, la enfermedad de Parkinson, el tinitus, los desordenes neurosiquiatricos y el dolor neurogénico. La secuenciación de los genes que codifican para los canales de cacio tipo T en pacientes que mostraron episodios de epilepsia de ausencia infantil mostró que presentaban mutaciones puntuales en la isoforma Cav3.2 de este tipo de canales. Estas mutaciones se concentran en el asa que conecta los dominios I y II de ese canal. Las mutaciones introducidas en canales recombinantes mostraron que estas generan canales con propiedades biofísicas diferentes, algunas de las cuales predicen un aumento de la excitabilidad de la membrana plasmática en modelos por computadora, lo cual puede conducir a la generación de patrones de disparo de las neuronas que tienen la misma frecuencia observada en los electroencefalogramas de los pacientes durante los periodos de epilepsia. Adicionalmente, estudios de la expresión de los canales recombinantes mutantes indicaron que la proporción de los canales expresados a nivel de la membrana plasmática aumenta, lo cual también puede ayudar a explicar la hiperexcitabilidad de las neuronas que expresan estos canales. De forma similar a lo que ocurre en los canales de calcio de alto umbral, el asa I-II es una región importante para la función y expresión de los canales de calcio de bajo umbral tipo T. Se reconoce en la región proximal del asa, ~ 60 aminoácidos, la presencia de un dominio denominado freno de la compuerta (“gating brake”), el cual presenta una estructura de dos hélices orientadas de forma antiparalela y con posibles interacciones electrostáticas entre residuos con cargas opuestas (Glu, Arg, Lys). La región distal del asa I-II tiene como papel el regular la proporción de canales que se localizan en la membrana plasmática. Por el momento se desconoce la forma como ambas regiones del asa I-II llevan a cabo sus funciones, por lo cual en este proyecto se propone la creación de quimeras entre los canales de calcio tipo con cinéticas rápidas, Cav3.1 y Cav3.2, con aquellos de cinéticas lentas, Cav3.3. La hipótesis del proyecto es que la estructura del freno de la compuerta es la misma en los tres miembros de la familia, y que sólo la interacción específica con otras regiones del canal promueve la regulación de la apertura/cierre del canal a través de ese dominio y que da por resultado ya sea canales con cinéticas lentas o con cinéticas rápidas. Por tanto se crearán inicialmente quimeras en las que las asas I-II de los canales de cinética rápida se intercambien con los de cinéticas lentas, esperándose que no ocurran cambios en las propiedades biofísicas de estos canales debido a que existen en el canal aceptor del asa sitios que interaccionan con el freno de la compuerta y que es la combinación de estas regiones lo que da por resultado el fenotipo del canal aceptor y no que el asa I-II determine el fenotipo. A continuación se añadirán en estas quimeras otras regiones, inicialmente el extremo carboxilo terminal y el asa III-IV, con el fin de promover en ellas las interacciones con el freno de la compuerta en el asa I-II y de esta forma transformar el fenotipo de un canal de activación rápida al de uno de activación lenta y viceversa. Las quimeras de los canales de calcio tipo T se obtendrán mediante la técnica de la extensión del empalme por la PCR ("overlapping extensión PCR"). La expresión de los canales quiméricos se realizará en ovocitos del Xenopus laevis, el cual es sistema de expresión robusto y ampliamente usado para este tipo de estudios. Las corrientes generadas por los cambios de voltaje aplicados se registrarán mediante la técnica de fijación del voltaje de dos electrodos. A partir del análisis de estos registros se determinarán las propiedades biofísicas de los diferentes canales quiméricos y se les comparará con las de los tipo nativo.

El presente proyecto se enfoca al estudio de las propiedades biofísicas de los canales de calcio dependientes del voltaje de bajo umbral tipo T. Aun cuando las corrientes de calcio de bajo umbral fueron descritas desde hace varias décadas, no fue sino hasta finales de los noventas cuando se pudo determinar la identidad molecular de los canales iónicos responsables de la generación de este tipo de corrientes después de muchos intentos infructuosos por varios grupos de investigadores, en contraste con los miembros del otro grupo de canales de calcio dependientes del voltaje, i. e. los de alto umbral, cuya clonación fue relativamente sencilla debido a la abundancia de ellos en algunos tejidos, lo que facilito su purificación y caracterización bioquímica, lo cual a su vez permitió contar con secuencias parciales de su estructura primaria y posteriormente la secuencias de sus cADNs mediante técnicas de clonación convencionales debido a la alta homología en las secuencias de aminoácidos que existe entre los miembros de este grupo. No obstante que las estructuras tridimensionales predichas para los canales de calcio de bajo y alto umbral son similares, al parecer su estructura cuaternaria son distintas, lo mismo que sus características biofísicas y por tanto su papel fisiológico es también diferente. Debido a la falta de fármacos que específicamente bloqueen o activen a los canales de calcio de bajo umbral, su función exacta durante largo tiempo permaneció en la especulación. Sin embargo, a raíz de su identificación a nivel molecular y con el advenimiento de nuevas técnicas genéticas, tales como la de los ratones transgénicos “knockout”, muchas de las predicciones se han corroborado y además se ha iniciado el diseño de nuevos compuestos que específicamente bloqueen o activen a tipo de canales de calcio. Los canales de calcio dependientes de calcio de bajo umbral se encuentran ampliamente distribuidos en las diferentes regiones del cerebro, además de en algunos otros tejidos en el cuerpo humano. La función inadecuada de estos canales se ha asociado con enfermedades y procesos fisiopatológicos tales como epilepsia de ausencia, la enfermedad de Parkinson, el tinitus, desórdenes neurosiquiatricos y el dolor neurogénico. Luego entonces, el entender la forma como este tipo de canales funcionan es importante no sólo desde un punto de vista meramente científico, i. e. por el conocimiento per se, sino además por el hecho de que este conocimiento puede ayudar a entender de una mejor manera como se generan los síntomas asociados con los padecimientos en los que la disfunción de los canales tipo T esté involucrada, y de esta forma poder proponer alternativas para la cura de las enfermedades o para el alivio de los síntomas. También el saber la forma como estos canales funcionan puede dar pautas acerca del diseño de las sustancias que se podrían emplear para el tratamiento y/o alivio de los síntomas de esas enfermedades. Asímismo, existe una clara congruencia desde el punto de vista del Plan de Desarrollo Institucional de la Facultad de Estudios Superiores Iztacala, lugar en que se desarrollará el proyecto, ya que se imparten en ellas carreras de índole biomédico (Biología, Medicina, Odontología), y la creación de una nueva línea de investigación como la propuesta en este documento podría fortalecer las ya existentes, con algunas de las cuales se presenta una relación evidente, como la que conduce el Dr. Jaime Barral en el laboratorio de Electrofisiología en la UIICSE, además de otras con las que puede haber temas comunes de interés. Por otra parte, el contar con un laboratorio en el que se lleve a cabo trabajo de investigación básica ofrece a los alumnos de las carreras ya mencionadas opciones para la realización del servicio social, elaboración de tesis y para los LICyT (Laboratorio de Investigación Científica y Tecnológica) en el caso de la carrera de Biología. También el exponer a los estudiantes de la carreras de la Facultad al ambiente de un laboratorio de investigación les proporciona la oportunidad de elegir por esta opción para su desarrollo profesional, sobretodo a los estudiantes de la carrera de Biología, muchos de quienes optan por esta alternativa. Esta situación igualmente favorece que se identifique a aquellas personas quienes manifiesten interés por las actividades de investigación, y se les estimule a realizar estudios de posgrado (Maestría o Doctorado) ya sea permaneciendo en el propio laboratorio o en otra institución de educación superior. Todo lo anteriormente expuesto permite concluir que el establecimiento de un laboratorio en el que se elabore investigación básica da lugar a la generación de conocimiento y de recursos humanos con capacidad para conducir de forma independiente más investigación, o bien que se incorporen a las diferentes Escuelas y Universidades de educación superior y coadyuvar así al mejoramiento y desarrollo del país en general. Finalmente, el establecimiento de investigadores independientes en las escuelas, cuyos trabajos se publiquen en revistas internacionales con puntaje, da lugar a que el prestigio de la escuela mejore y se cree una atmósfera que atraiga más investigadores y que propicie de esta forma la atracción de mayores recursos para fortalecer aún mas el trabajo de investigación.