Las Activinas e Inhibinas son ligandos dimericos (ββ y αβ, respectivamente) miembros de la superfamilia del TGFβ, y tienen un papel crucial en la regulación de distintos procesos celulares tales como diferenciación, proliferación, apoptosis, ciclo celular, migración, etc. Nuestro grupo ha investigado el papel de las Activinas/Inhibinas en el proceso de desarrollo de los linfocitos T en el timo, reportando que éstas regulan la diferenciación de timocitos en distintos estadios de maduración durante los procesos de selección y elección de linaje. Nuestro laboratorio ha reportado que estos ligandos se expresan abundantemente en el estroma tímico, que se encuentra constituido por distintos tipos celulares, incluyendo células epiteliales, macrófagos, fibroblastos y células dendríticas (DC). Además, de expresar los ligandos, el estroma tímico también expresa receptores tipo I y tipo II para Activinas (Alk4, ActRIIA), por lo que las células estromales pueden ser susceptibles a las señales inducidas por Activinas/Inhibinas. En base a esta evidencia, se postula que estos ligandos pudieran también regular la diferenciación de células dendríticas, las cuales representan un porcentaje elevado de las células presentes la médula tímica. Por otro lado, existen reportes que demuestran el papel de las Activinas en la diferenciación de las células de Langerhans en la epidermis, y existe evidencia que indica que las Activinas pueden modular la función de distintas células inmunes (monocitos, macrófagos, DCs, linfocitos T y B, mastocitos etc) en condiciones de homeostasis e inflamación. Puesto que las inhibinas son antagonistas por excelencia de las Activinas, postulamos que éstas podrían ser importantes reguladores de la diferenciación y función de células dendríticas convencionales. Las células dendríticas regulan la interfase entre inmunidad y tolerancia, por lo tanto el balance entre los efectos mediados por las Activinas e Inhibinas sobre las células dendríticas, podría tener un papel crucial en la regulación de la respuesta inmune. _x000D_ Esta propuesta tiene como objetivo principal evaluar el efecto de la ausencia de Inhibinas en la diferenciación, maduración y función de células dendríticas, tanto en el timo como en órganos linfoides periféricos. Debido al papel descrito para las DCs en la diferenciación de células T reguladoras, postulamos que la ausencia de Inhibina tendrá una repercusión en la generación de células T reguladoras tímicas y/o inducidas en periferia. Puesto que las Inhibinas comparten la cadena β con las Activinas, se postula que en ausencia de la cadena α, se generarán más homodímeros ββ, por lo que es probable que se incrementen los niveles de activinas. Ésto, en si mismo, podría tener una efecto en la maduración de células dendríticas y la generación de Tregs (exceso de señalización por Activinas). Sin embargo, no podemos excluir el efecto de la ausencia de señalización a través de las mismas Inhibinas, lo cual está apoyado por datos de nuestro laboratorio que indican que las Inhibinas pueden inducir la fosforilación de Smad2/3 en timocitos murinos, de manera independiente a las Activinas._x000D_ Para llevar a cabo este estudio, se analizarán las poblaciones de células dendríticas timicas y periféricas de ratones silvestres o Inhibin α ko (Inh α ko), mediante citofluorometría de flujo, así como mediante inmunohistoquímica. Para evaluar la función de las células dendríticas, se derivarán DC a partir de progenitores de médula ósea en presencia de GM-CSF, y se madurarán con LPS. A partir de Las células generadas in vitro se analizará su fenotipo, con anti- MHC Clase II, CD11c, CD80 y CD86, para evaluar su estado de maduración. Puesto que se ha demostrado el papel de las Activinas en procesos de migración, se analizará la capacidad migratoria de las DCs derivadas de MO de ratones Inh α ko o silvestres, y se llevarán a cabo experimentos de migración in vitro (ensayos de quimotaxis) e in vivo (ensayos de “homing” con DCs marcadas con “cell trackers”). Mediante la utilización de ratones transgénicos actin-GFP en fondo C57/BL6 y ratones transgénicos actin-YFP en fondo genético Inh α ko , se derivaran DCs a partir de progenitores de medula ósea, para realizar experimentos de migración competitiva. _x000D_ _x000D_ También se caracterizará el efecto de la ausencia de Inhibinas sobre la morfología de las DC inmaduras y maduras derivadas de progenitores de MO silvestres y Inh α ko en condiciones basales, así como su fenotipo migratorio en respuesta a las quimiocinas CCL19 y CCL21, mediante el análisis de la formación de estructuras ricas en actina (lamellas y filopodios), así como el citoesqueleto de tubulina mediante microscopía confocal. _x000D_ Para demostrar la funcionalidad de las DCs, se realizarán ensayos de proliferación utilizando co-cultivos de DCs derivadas de MO de ratones silvestres o Inh α ko y linfocitos T alogénicos o bien singénicos en respuesta al entrecruzamiento de CD3+CD28. _x000D_ Para analizar la generación de Treg, se cruzarán los ratones Inh α ko con ratones Foxp3 knock-in, que expresan el factor transcripcional Foxp3 fusionado a la proteina verde fluorescente (GFP), lo cual permite identificar a las células T reguladoras in vivo. _x000D_ Para fenotipicar las células T reguladoras se realizará tinción múltiple con CD4, CD25, CTLA-4 y GITR. Se analizará la proporción y número de células Foxp3+ CD25+ (o CD25-) en el timo, ganglio y bazo de los ratones Inh α ko o silvestres (en fondo Foxp3 knockin) en condiciones basales, y se analizará la conversión de células T reg inducidas, a partir de células T vírgenes (CD4+ CD25- Foxp3-) a células T reguladoras (CD4+CD25+ Foxp3+) estimuladas con anti-CD3+CD28, en presencia de TGFβ y/o Activina exógena, en presencia o ausencia del inhibidor Folistatina, mediante la identificación de células GFP+(Foxp3+) en los co-cultivos y analisis por citofluorometría de flujo._x000D_ Finalmente, para investigar si las inhibinas pueden regular el ambiente inflamatorio a través de su influencia en la generación y maduración de células dendríticas in vivo, se analizará el infiltrado linfocitario y las DCs de ratones machos Inh a ko, donde se generan tumores en los testículos, lo cual nos servirá como modelo para evaluar la respuesta anti-tumoral in situ en ausencia de Inhibinas._x000D_

4. CONTRIBUCION DEL PROYECTO_x000D_ En la actualidad existen evidencias que demuestran papel de las Activinas y del TGFβ en la diferenciación de las células de Langerhans de la epidermis, en la modulación de las células dendríticas derivadas de médula ósea y el sinergismo con TGFβ en la inducción de células T reguladoras periféricas. Sin embargo, se desconoce por completo el papel de las Inhibinas en dichos procesos. Nuestro grupo ha reportado previamente que, de manera opuesta al dogma que propone a las Inhibinas como antagonistas clásicos de las señales mediadas por Activinas, éstas no antagonizan todas las funciones de las Activinas durante el proceso de desarrollo de los timocitos: por ejemplo, ambas promueven el paso de DN3 a DN4 (proceso de selección β o pre-TCR signaling), sin embargo, las Inhibinas promueven la transición de DN4 a DP, mientras que las Activinas inhiben esta transición, induciendo un acúmulo de una subpoblación inmadura intermedia CD8+ ISP (“intermediate single positive”)[40]. Estos datos indican que la acción de estos ligandos depende del estadio de diferenciación de la célula sobre la cual ejercen su función. De manera similar, existe gran evidencia que muestra que los efectos de las Activinas sobre distintas células inmunes difiere dependiendo si la células se encuentran en reposo o bien en condiciones de activación (revisado en Aleman-Muench G and Soldevila G, sometido). Por otro lado, datos preliminares de nuestro laboratorio han confirmado la activación de Smad2/3 mediante estímulo con inhibinas en las diferentes subpoblaciones de timocitos en desarrollo (en preparación), lo cual podría explicar nuestros datos que muestran la ausencia de antagonismo de las Inhibinas en las acciones mediadas por las Activinas en el timo._x000D_ Nuestro proyecto está enfocado a dilucidar el papel de las Inhibinas en la diferenciación, maduración y función de las DCs. Si bien existe ya evidencia del papel de las Activinas en la inducción de Treg periféricas, no se ha demostrado un papel de éstas en la diferenciación de DC timicas. Además, se desconoce por completo el papel de las Inhibinas tanto en la diferenciación y función de las DCs a nivel de timo y de periferia._x000D_ Las células dendríticas tímicas tiene un papel crucial en el establecimiento de tolerancia central, y son las principales mediadoras del proceso de deleción (selección negativa) que permite erradicar la gran mayoría de linfocitos T autorreactivo del repertorio de células T de un individuo. Además se ha demostrado que pueden participar en la selección de nTregs en la médula tímica. Por ello, el estudio del papel de las inhibinas en el timo tiene una gran relevancia en el proceso de tolerancia central. Por otro lado, durante la respuesta immune también se generan células T reguladoras inducidas y se ha demostrado que las DCs tienen un papel crucial en la conversion de células CD4+ naïve a células T reguladoras, tanto las células Foxp3+, como otros subtipos de celulas reguladoras como las Tr1 y las Th3.Por lo tanto es importante evaluar si las inhibinas, a través de su efecto sobre la maduración y función de las DC periféricas, pueden regular el establecimiento de tolerancia en la periferia. _x000D_