En este proyecto se estudiará funcional y estructuralmente a una novedosa proteína inhibidora de la ATP sintasa de la alfa-proteobacteria Paracoccus denitrificans que hemos descubierto recientemente. Se trata de un mecanismo de control nunca antes descrito en ninguno de los tres tipos de F1F0-ATP sintasas conocidos, es decir, las enzimas mitocondriales, de cloroplastos o de bacterias. Este motor molecular es ubicuo dado que provee a casi todos los seres vivos de energía química en forma de ATP sintetizado a partir de ADP y Pi . Está bien establecido que esta enzima es el motor molecular más pequeño y eficiente de toda la naturaleza; el giro de su rotor central es impulsado por un flujo de protones (en algunas bacterias iones sodio) por su canal F0, y este giro es transmitido por la subunidades gamma y épsilon del cuello central de la enzima hacia la parte catalítica (F1) para liberar al ATP sintetizado. En todas las ATP sintasas bacterianas descritas hasta ahora, la subunidad épsilon del cuello central funciona como un inhibidor selectivo de la rotación en el sentido de la hidrólisis del ATP. Esto lo logra al extender dos alfa-hélices de su extremo C-terminal para enredarlo con la subunidad gamma y así bloquear el giro solamente en el sentido de la hidrólisis. El caso de la ATP sintasa de Paracoccus denitrificans es de suma importancia al ser una alfa-proteobacteria similar al endosimbionte que dió origen a las mitocondrias. Además del interés evolutivo esta enzima es la ATP sintasa más rápida para sintetizar al ATP y al mismo tiempo la F-ATPasa más lenta para hidrolizarlo, haciéndola una enzima prácticamente unidireccional en el sentido de la síntesis del ATP. Pese a todo esto, la enzima de P. denitrificans nunca se había aislado en forma nativa y funcional, y por lo tanto se desconoce tanto su composición de subunidades como su mecanismo de regulación. Para resolver estas preguntas fundamentales, mi laboratorio se ha dado a la tarea de purificar a la F1F0-ATP sintasa y a la F1-ATPasa en sus formas nativas y funcionales a partir de vesículas invertidas de la membrana de P. denitrificans. Después de obtener ambas preparaciones en sus formas estables y funcionales, encontramos sorprendentemente una sexta subunidad de 11kDa adicional a las 5 subunidades que normalmente conforman a la F1-ATPasa bacteriana (alfa, beta, gamma, delta y épsilon). De acuerdo a nuestra hipótesis inicial proveniente de estudios de activación de la enzima por proteólisis limitada, esta proteína de 11kDa resultó ser un fuerte inhibidor de la actividad de F1F0-ATPasa activada con oxianiones (sulfito), con lo cual encontramos un nuevo mecanismo de control de la ATP sintasa bacteriana, nunca antes descrito. Por todas estas razones, es de suma importancia para el campo resolver el mecanismo inhibitorio y la estructura de esta proteína inhibitoria de 11kDa, y su posible correlación con la subunidad épsilon presente en la enzima de esta bacteria. Para ello se determinará el mecanismo cinético de inhibición de esta proteína sobre las actividades de F1F0-ATPasa y F1-ATPasa de P. denitrificans, así como la estructura secundaria (por dicroísmo circular) y el estado de agregación (por filtración en gel y geles nativos) de esta proteína. Asimismo, se estudiará la posible interacción de esta proteína con subunidades vecinas en la F1-ATPasa de esta bacteria por medio de entrecruzamientos químicos y estudios de reconstitución y de asociación con otras subunidades de la enzima. En paralelo, se intentará cristalizar a la F1-ATPasa o a la subunidad de 11 kDa de P. denitrificans para resolver en lo posible su estructura terciaria y cuaternaria en la F1-ATPasa de esta bacteria. Con los resultados obtenidos se resolverá un mecanismo totalmente novedoso de regulación de la ATP sintasa bacteriana, y también se determinará si este mecanismo se conserva en otras alfa-proteobacterias donde se encuentra el marco de lectura abierto de esta proteína. De particular relevancia es el hecho de que los resultados que se obtengan determinarán si el mecanismo de inhibición de esta proteína de 11 kDa involucra o no la regulación del cuello o rotor central de la F1-ATPasa de P. denitrificans. Si es el caso, se abre una nueva línea de investigación en la regulación de la rotación del nanomotor F1F0 bacteriano, sino es el caso, se abre otra línea para determinar el mecanismo de inhibición de esta proteína sobre los sitios catalíticos de porción F1 de la enzima. Finalmente, también se generarán mutantes de ablación y de sitio único en esta proteína de 11kDa para ver su efecto en el crecimiento aerobio y anaerobio de P. denitrificans y las posibles aplicaciones de estas mutantes a procesos de bioremediación en donde se ha propuesto que P. denitrificans puede contribuir gracias a su cadena respiratoria desnitrificante.

Este proyecto abrirá la pauta para resolver un mecanismo completamente novedoso de regulación en el campo de la catálisis rotacional del nanomotor F1F0-ATP sintasa bacteriana. El impacto de este nuevo mecanismo es muy alto por tratarse de la posible regulación de la rotación del cuello central de la enzima por una proteína completamente nueva.