La amibiasis, enfermedad ocasionada por el parásito Entamoeba histolytica, sigue posicionada como la tercera causa de muerte por protozoarios en el mundo. El ciclo de vida del parásito consta de dos estadíos bien diferenciados morfológicamente, el trofozoíto o forma vegetativa e invasora, y el quiste o forma de resistencia e infectiva. La transmisión de la enfermedad depende de esta estructura que mide de 10-15 micras de diámetro, posee una pared de quitina, presenta cuerpos cromatoides y tiene 4 núcleos en su forma madura. Gracias a esa cubierta de quitina, los quistes resisten el paso por el estómago alcanzando el íleon, lugar donde se propone que desenquistan, liberando los trofozoítos. Éstos al alcanzar la parte baja del intestino grueso, se enquistan de nueva cuenta, para salir con la materia fecal. _x000D_ A pesar de la incuestionable importancia del quiste para mantener el ciclo de vida de la amiba entre humanos (no existe reservorios conocidos en esta enfermedad), se desconoce los estímulos luminares que llevan a la interconversión de fases, y menos aún, los cambios moleculares asociados a la misma. Algunos esfuerzos aislados, como el recientemente reportado por nuestro grupo (1) que incluye el tratamiento con peróxido de hidrógeno y cationes divalentes, han logrado la obtención de estructuras tipo quiste (ETQs) con una o varias características de quistes reales. En nuestro caso, se obtuvieron las ETQs más cercanas a un quiste maduro, con estructuras tetranuceladas y una pared de quitina que les confiere resistencia a detergentes (1). Sin embargo, ya que la mayoría de las ETQs obtenidas son bi o trinucleadas y contienen cuerpos cromatoides, consideramos que realmente pueden tratarse de un estadio intermedio entre el trofozoíto y el quiste, lo que lo hace muy interesante para estudiar el fenómeno de conversión de una fase a otra. A este respecto, con la excepción de un reporte de microarreglos (hecho con quistes no reales de humano y que no necesariamente representa el proteoma; 2), no existe información sobre los cambios en el perfil proteómico asociado al enquistamiento, incluyendo la formación de la pared del quiste, lo que podría generar información acerca de cómo controlar ese proceso y bloquear el ciclo de vida. Estudios de este tipo se han llevado a cabo en otros parásitos como Giardia lamblia, el cual se enquista fácilmente in vitro (3)._x000D_ Siendo la pared del quiste el elemento clave de su resistencia, la mayoría de estudios moleculares en otros parásitos que se enquistan fácilmente, como Entamoeba invadens y G. lamblia, se han centrado en la activación de la ruta de biosíntesis de este compuesto y de las enzimas involucradas. Así, en E. invadens, se han estudiado las quitina-sintasas, enzima que participan en la última parte de la vía (4), mientras que en Giardia, se ha estudiado la cascada completa que comprende 5 enzimas, haciendo hincapié en la glucosamina 6-fosfato isomerasa, la enzima limitante de la vía (5). En este parásito, el inicio del enquistamiento se correlaciona con la sobre-expresión de esta enzima, mientras las otras son dependientes de sustrato. Interesantemente, una ruta idéntica a la del enquistamiento en Giardia, ha sido sugerida en amiba a partir de los datos generados del proyecto del genoma de este parásito, con la excepción de un solo cambio en la parte final de la vía: polimerización de N-acetil-glucosamina (esto es la quitina) en amiba en lugar de un paso adicional que lleva a polimerización de N-acetil-galactosamina (no quitina) en Giardia. Sin embargo, no se ha reportado ningún estudio sobre la expresión y actividad de estas enzimas en la amiba, probablemente debido a la dificultad para enquistar este parásito in vitro. Recientemente, nosotros hicimos el primer aporte al respecto al reportar la sobre-expresión del gen de la glucosamina 6-fosfato isomerasa en las ETQs, sugiriendo que la vía se activó como resultado de nuestro tratamiento y por ende, se activó el enquistando (1). Esta expresión disminuyó en quistes maduros purificados de materia fecal, lo que apoya la idea de que nuestras ETQs pueden encontrarse en estado de transición intermedio entre el trofozoíto y el quiste, lo que hace posible el estudio de los cambios en el perfil de expresión durante el proceso de enquistamiento, incluyendo aquellos asociados a la generación de la pared quística. _x000D_ _x000D_ El objetivo del presente proyecto será el de analizar el perfil proteómico de trofozoítos, quistes y ETQs, y determinar los cambios de expresión diferencial asociados al proceso de enquistamiento en E. histolytica, con particular énfasis en la ruta de biosíntesis de la quitina. _x000D_ _x000D_ Para ello, se utilizarán i) trofozoítos de la cepa HM1:IMSS de E. histolytica cultivados en medio TYI-S-33, ii) quistes maduros (tetranucleados) previamente aislados de materia fecal de pacientes con amibiasis intestinal, y confirmado como positivos para E. histolytica por PCR sobre DNA aislado de los quistes (6) y iii) ETQs, obtenidas in vitro por tratamiento de los trofozoítos con 4 mM de peróxido de hidrógeno con cationes divalentes por 6 h (1). El presente estudio estará dividido en dos partes. Por un lado, extractos proteicos de las 3 muestras a varias concentraciones, se separarán en geles SDS-PAGE, se cortarán bandas a todo lo largo del gel, y se procesarán para la identificación de péptidos mediante MALDI-TOF, una técnica de espectrometría de masas que permite la identificación de la huella peptídica. La identidad de las proteínas se determinará mediante la ayuda del programa MASCOT, empleando bases de datos de E. histolytica y otras amibas disponibles en TIGR (estos estudios se llevarán a cabo con la colaboración del Dr. Damer Blake y Richard Oakes del Instituto de Salud Animal de Inglaterra, quienes han reportado estudios de proteómica en estadíos de diferenciación del parásito de aves Eimeria Tenella; 7). Una vez obtenido el perfil de expresión de cada uno de los estadios mencionados arriba, se evaluará la expresión diferencial y se determinarán los cambios moleculares asociados al proceso de enquistamiento en la amiba. Gracias a los datos derivados de las ETQs (fase intermedia), trataremos de proponer un modelo general de interconversión de estadíos en este parásito, e identificar blancos para controlar la formación del quiste. Por el otro lado, ya que nos interesa de manera particular la ruta de síntesis de quitina, se estudiará los cambios en esta vía a través de ensayos de RT-PCR y actividad enzimática de las enzimas que teóricamente participan en el proceso. Para ello, se identificarán las secuencias codificantes de las 5 enzimas de la ruta de biosíntesis de quitina en la base de datos de la amiba, se diseñarán “primers” para cada una de ellas, y se llevará a cabo RT-PCRs semi-cuantitativos sobre RNA aislado de las 3 muestras. Como control interno, se amplificará el mensajero del factor de ribosilación dependiente de ATP, que ha sido demostrado que se mantiene expresado en quistes en otros parásitos y que nuestro grupo ya utilizó para los RT-PCRs de la glucosamina-6-fosfato isomerasa. Estos ensayos se complementarán con la evaluación de la actividad de al menos 2 enzimas de la ruta de formación de quitina (glucosamina-6-fosfato isomerasa y quitina sintasa; aunque intentaremos evaluar las cinco) en extractos de las 3 muestras preparados en presencia de inhibidores de proteasas. Para estos estudios de actividad, nos basaremos en aquellos descritos para la ruta de enquistamiento de Giardia (5) con la colaboración de la Dra. Emma Saavedra, experta en estudios del metabolismo de E. histolytica. _x000D_ _x000D_ Relevancia e impacto del proyecto propuesto en el área de estudio: _x000D_ Siendo el ciclo de vida de la amiba exclusivo del ser humano y completamente dependiente del quiste, el estudio de los mecanismos moleculares involucrados en la conversión de un estadío a otro, además de aportar al conocimiento de la biología del parásito, podría permitir la identificación de nuevos blancos exclusivos del quiste (los mamíferos no poseen quitina) y con ello, el desarrollo de nuevos fármacos y estrategias para tratar la enfermedad. Si esto llegara a funcionar, e

La amibiasis es aún un serio problema de salud pública en muchos países, incluyendo el nuestro. La transmisión de la enfermedad depende de la formación de una estructura de resistencia, el quiste, y en particular de su pared celular. A pesar de la importancia de este estadío, es muy poco lo que sabe sobre los estímulos externos que inducen el enquistamiento y desenquistamiento en la amiba, y menos aún sobre los cambios moleculares que llevan a la interconversión de estadíos. _x000D_ Nosotros hemos comenzamos a contribuir al esclarecimiento de los estímulos que inducen el enquistamiento en la amiba, al demostrar que la formación de estructuras tipo quistes (ETQs) es dependiente de estrés oxidativo y de cationes, que además de contrinuir al estrés (hierro y cobre), pueden funcionar como cofactores de enzimas de la ruta de biosíntesis de la quitina (Manganeso, magnesio, cobalto, etc) (Aguilar y cols, PLoSNTD 2010, 16;4(2):e607). _x000D_ Ahora, gracias al hecho de que las ETQs tienen características de un estadío de diferenciación intermedio entre trofozoítos y quistes maduros, nosotros proponemos su uso para determinar el perfil de expresión proteica (proteoma) asociado al proceso de enquistamiento de la amiba, con énfasis en la ruta de biosíntesis de quitina, el principal componente de la pared del quiste, contribuyendo de manera importante a dilucidar los mecanismos moleculares implicados en la interconversión de estadíos en este parásito._x000D_ Teniendo en cuenta que la quitina y su ruta de biosíntesis está ausente en mamíferos y que el humano es el único reservorio conocido de la amibiasis, este proyecto, además de lo anterior, podría llevar a la identificación de nuevos blancos para el desarrollo de vacunas y mejores drogas anti-amibianas, que no sólo podrían llegar a proteger contra un eventual episodio de amibiasis intestinal, sino que además al afectar el proceso de enquistamiento, podría llevar a la interrupción del ciclo de vida y por ende a la erradicación de la enfermedad. _x000D_ _x000D_ Finalmente, la realización de este proyecto bajo mi dirección permitirá la obtención del grado de Doctor en Ciencias Biomédicas de la alumna Milka Azucena Luna Nacar, y la realización de una tesis de licenciatura para un estudiante que se incorporaría oportunamente.