RESUMEN_x000D_ _x000D_ En la presente propuesta de investigación se propone estudiar la diversidad y genética evolutiva de poblaciones de Escherichia coli aisladas de dos ríos de Morelos con grado contrastante de contaminación, usando estrategias dependientes (clásica) e independientes (metagenómica) de cultivo, con el fin de conocer el efecto del impacto antropogénico sobre la incidencia y distribución ambiental de E. coli, así como de genes de virulencia característicos de patotipos EPEC y ETEC y de genes de resistencia portados en casetes (integrones). Concretamente se propone:_x000D_ i) Evaluar la diversidad genética de aislados ambientales de Escherichia coli en base al análisis multilocus de secuencias del “core” o núcleo genómico (36), de algunos genes accesorios de virulencia (eae y tir) y de resistencia a antibióticos asociados a integrones y plásmidos._x000D_ ii) Análisis de diversidad de genes de virulencia [(eae, tir), (sta, stb, lt)] indicadores de patotipos EPEC y ETEC de E. coli (respectivamente) y de genes de resistencia a antibióticos en muestras de DNA metagenómico purificado de las mismas muestras empleadas para el aislamiento de coliformes. _x000D_ _x000D_ _x000D_ INTRODUCCION_x000D_ _x000D_ Tradicionalmente se ha considerado la detección de bacterias coliformes como indicio de contaminación fecal residual. Entre estas bacterias existen especies que son capaces de colonizar el tracto intestinal de humanos y otros vertebrados. Estas son conocidas como coliformes fecales. Algunas de estas bacterias son patógenas para ciertos hospederos, mientras que otras cepas de las mismas especies son comensales y componentes de la microbiota intestinal de individuos sanos (21). Escherichia coli es el principal anaerobio facultativo que habita el colon humano. De ahí que su sola presencia en el entorno se considere reflejo de contaminación fecal (52). Se sabe también que, en el ambiente, E. coli es capaz de sobrevivir y en condiciones favorables, replicarse hasta alcanzar altas densidades (18, 48)._x000D_ El trabajo pionero de genómica comparativa de Welch y col. (49) entre tres cepas de E. coli (una enterohemorrágica, una uropatogénica y K12) demostró que el genoma de esta especie tiene estructura en mosaico. Las 3 cepas comparten sólo el 39% de los genes (genoma “core” o núcleo), el resto conformando lo que se conoce como genoma accesorio. Esta conclusión está ampliamente validada por estudios posteriores que analizaron 17 genomas de la especie (36). La mayoría de los genes accesorios están en segmentos genómicos de 4 kb a 100 kb, su contenido de GC y uso de codones es distinto al del core. En estas regiones se encuentran “hot spots” de recombinación, así como islas de patogenicidad (PAIs, Pathogenicity Associated Islands) (12). La plasticidad genómica de estas zonas, los mecanismos de recombinación homóloga y no homóloga, así como el enorme tamaño efectivo de las poblaciones de estas bacterias explican la alta variabilidad entre las cepas, así como la aparición de nuevos patotipos (21)._x000D_ Algunos de los mecanismos que generan las alteraciones genómicas son: la transferencia horizontal, la duplicación génica y las deleciones (1). En particular se sabe que la transferencia horizontal tiene implicaciones epidemiológicas importantes; en E. coli los diferentes patotipos están dados en gran medida, por la presencia de plásmidos y PAIs específicos de algún patotipo (37, 53). Es decir, una cepa no patógena puede adquirir genes determinantes de virulencia (12). Sumado a ésto, el uso indiscriminado de antibióticos ha provocado la aparición de cepas multi-resistentes, que con frecuencia surgen por co-transferencia horizontal con marcadores de virulencia de PAIs (2, 7, 13). La transferencia horizontal de genes es facilitada por elementos genéticos como plásmidos, transposones e integrones. Los integrones son sistemas de captura y expresión de genes (3, 16). Los genes capturados por los integrones (casetes) son la forma más simple de elementos móviles conocidos, consisten sólo de un gen y un sitio de recombinación. Los integrones pueden estar localizados en plásmidos, facilitando el intercambio genético entre organismos. De esta manera se pueden capturar genes del ambiente, transferirlos y expresarlos rutinariamente entre la misma o diferentes especies bacterianas (33). La multi-resistencia a antibióticos en Enterobacterias está fuertemente asociada a la presencia de integrones (25, 50). Algunos estudios pioneros han revelado que en los ambientes naturales también es posible recuperar una variedad de integrones a partir de DNA ambiental (16, 43). _x000D_ _x000D_ El MLST y MLSA (Multilocus Sequence Typing/Analysis) representan en la actualidad las técnicas más sensibles y efectivas para la genotipificación de estas bacterias en el contexto de estudios epidemiológicos, así como para estudiar su ecología y genética evolutiva (11, 31), existiendo actualmente varias bases de datos públicas dedicadas a MLST para diversas especies de bacterias patógeneas (www.mlst.net; http://pubmlst.org/). Paralelamente se han desarrollado diversos esquemas de PCR múltiple para tipificación de patotipos en base al contenido de genes de virulencia y de resistencia a antibióticos (22, 34). _x000D_ Existen seis patotipos bien caracterizados de E. coli (21). Por su relevancia en el contexto de la salud pública Mexicana y del proyecto de investigación propuesto, nos enfocaremos al estudio de dos de ellos, ambos causantes de diarreas: EPEC y ETEC. E. coli enteropatogénica (EPEC) y enterotoxigénica (ETEC) son importantes agentes causales de diarreas potencialmente mortales en niños en países subdesarrollados, con alta incidencia en México (8, 44). Ambos patotipos se encuentran entre los mejor estudiados, incluyéndose genomas completamente secuenciados (36). La infección con EPEC se caracteriza por la lesión del tipo de adherencia y eliminación (A/E) en las células epiteliales, causado por genes codificados en la PAI-LEE (locus of enterocyte effacement) (6, 21), mientras que la infección con ETEC conduce a diarrea por secreción de toxinas termo lábiles (LTs) o estables (STs), toxinas estructuralmente relacionadas con la enterotoxina colérica (21)._x000D_ _x000D_ _x000D_ PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA_x000D_ _x000D_ Actualmente, los estudios sobre diversidad de bacterias patógenas y de los genes de resistencia/virulencia (res/vir) asociados a éstas se han centrado casi exclusivamente en aislados clínicos. Sin embargo, estas bacterias se encuentran en importantes cantidades en el medio ambiente y poco se sabe sobre la diversidad, distribución y dispersión de las mismas (y de sus genes de res/vir) fuera del ambiente clínico. Describir y conocer estos patrones de diversidad y distribución ambiental es de suma importancia para poder entender mejor el surgimiento de nuevos patotipos y patrones de multiresistencia a agentes antimicrobianos. Son muy escasos los estudios que existen actualmente sobre estos aspectos (18, 48). _x000D_ México y Morelos ofrecen (lamentablemente) excelentes oportunidades para el estudio de la diversidad y distribución ambiental de coliformes y sus genes de res/vir, ya que la contaminación severa de ríos y lagos con aguas residuales está ampliamente extendida. A lo largo de Cuernavaca y otros municipios de Morelos, la cuenca más contaminada es la del Apatlaco. Cruza la ciudad de norte a sur y a lo largo de su trayecto cerca de 500,000 intestinos descargan materia fecal en él, ya sea directa o indirectamente. A pesar de que las aguas de este río están prohibidas para uso humano, esta corriente desemboca en el río Amacuzac, que es utilizado para múltiples actividades humanas como riego y recreación. Los ríos Apatlaco y Tembembe se originan a partir de los escurrimientos de la Sierra de Zempoala. Ambos se encuentran localizados en la zona norponiente del estado de Morelos, formando parte de la Región Hidrológica del Río Balsas. Las subcuencas del Alto Apatlaco-Tembembe tienen importancia estratégica para la región ya que recargan directamente el acuífero “Cuernavaca”. El grado de perturbación de cada río difiere considerablemente a pesar de presentar condiciones geomorfológicas, climatológicas y de composición de la biota original muy similares. El río Apatlaco (el c

A la fecha no existen trabajos sobre la diversidad y distribución ambiental de genes de vir/res detectados directamente en DNA de la comunidad, existiendo sólo unos pocos sobre coliformes ambientales, todos basados en el análisis de cepas aisladas en cultivo puro (4, 13, 15, 17-19, 48, 52, 54). Nuestra propuesta es por tanto novedosa y de gran impacto potencial en el área de ecología molecular bacteriana y de salud pública. La aproximación aquí propuesta, complementada con la gran cantidad de información existente al respecto sobre aislados clínicos en bases públicas de secuencias, ayudará a determinar de manera más completa la estructura genética, diversidad y distribución ambiental de las poblaciones de coliformes y de sus genes de vir/res, tópicos de gran interés en ciencia básica y biomedicina. _x000D_ _x000D_ En el marco de este proyecto de investigación se formarán al menos tres estudiantes, uno a nivel de doctorado y otros dos a nivel de licenciatura (aún por incorporar al grupo), y se espera publicar al menos tres trabajos en revistas de alto perfil. Se generarán y depositarán en bases de datos públicas (GenBank) más de 1,000 secuencias nuevas de aislados bacterianos (E. coli), y al menos otras 4000 generadas de amplicones ambientales para 2 genes del core genómico y 4 genes accesorios de bacterias entéricas (vir/res). Este proyecto mostrará por primera vez la magnitud real de la diversidad de E.coli y de algunos de sus genes accesorios en diversas muestras ambientales, gracias al uso complementario de aproximaciones dependientes de cultivo y metagenómicas, lo cual representará una aportación mayor al campo de la ecología microbiana. Finalmente, en la presente propuesta se plantea desarrollar un protocolo de PCR multiplex para genes de virulencia de patotipos EPEC y ETEC de Escherichia coli para la evaluación rápida del “potencial de patogenicidad” de diversas muestras ambientales, en particular de agua. Estos protocolos se espera sean de gran utilidad e impacto en microbiología clínica y ambiental, y tienen el potencial de ser patentables._x000D_