El objetivo de este proyecto es analizar la interacción temprana entre el parásito Leishmania mexicana y las células dendríticas, así como la capacidad del parásito de modular los mecanismos microbicidas de la célula, específicamente la producción de óxido nítrico catalizada por la sintasa inducible del óxido nítrico (iNOS). Leishmania es un parásito intracelular que infecta principalmente macrófagos y células dendríticas. Este parásito es el agente causal de la leishmaniasis que abarca un amplio espectro de enfermedades, desde un polo benigno como lo es la leishmaniasis cutánea localizada hasta un polo maligno como lo es la leishmaniasis cutánea difusa. Se considera que en el amplio espectro de manifestaciones clínicas causadas por este parásito están involucrados diversos factores tales como la especie y el estadío del parásito infectante, la distribución geográfica y la respuesta inmune del hospedero. Dentro de la respuesta inmune del hospedero, la interacción temprana de Leishmania con las células posteriormente a la inoculación por el vector, es muy importante. Se ha determinado, por ejemplo, que la interacción inicial con macrófagos o células dendríticas provoca la secreción de diferentes citocinas que tienen diferentes efectos sobre el destino del parásito en el hospedero. En los macrófagos infectados con Leishmania se produce principalmente IL-10 y en las células dendríticas se produce principalmente IL-12. Estas dos citocinas tienen efectos opuestos. La IL-10 es una citocina reguladora negativa que inhibe la activación de los macrófagos y las células dendríticas, por lo que su producción favorece la persistencia del parásito. De manera contraria, la IL-12 es una citocina predominantemente proinflamatoria que activa a las células NK para la producción de IFN-gamma y éste activa a los macrófagos para la destrucción del parásito. Como se observa, el que el parásito Leishmania infecte inicialmente a un tipo celular o a otro, tiene consecuencias trascendentales en el desarrollo de la enfermedad. Por esta razón, consideramos de gran importancia analizar la interacción temprana del parásito con las células dendríticas y algunos de los mecanismos que le permiten sobrevivir dentro de estas células. Específicamente en este proyecto se van a analizar algunos de los receptores involucrados en la fagocitosis de amastigotes y promastigotes de Leishmania mexicana por células dendríticas y el efecto de los parásitos sobre uno de los mecanismos microbicidas más importantes como lo es la producción de óxido nítrico. Se ha demostrado con una especie diferente del parásito, que es Leishmania major, que el estadío que infecta principalemente a las células dendríticas es el amastigote y lo hace a través de los receptores para el fragmento Fc de las inmunoglobulinas. Esto fue demostrado con células dendríticas murinas. Nosotros trabajaremos con células dendríticas humanas y con la especie Leishmania mexicana. En el caso de este parásito está demostrado que existen diferencias importantes en las respuestas entre las diferentes especies, por lo que será muy importante trabajar con Leishmania mexicana, de la cual no hay reportes sobre la fagocitosis por células dendríticas. Por otro lado, el papel de las células dendríticas como células efectoras en la eliminación de diferentes organismos patogénicos ha sido muy poco estudiado. Se sabe que poseen la maquinaria microbicida constituída por la NADPH oxidasa e iNOS y se ha descrito el papel del óxido nítrico producido por células dendríticas en la eliminación de algunas bacterias como Salmonella. Las células dendríticas han sido consideradas células en las cuales el parásito puede sobrevivir, incluso algunos autores las han llamado santuario, por lo que pensamos que el parásito debe ejercer alguna inhibición en el mecansimo microbicida más importante que es el óxido nítrico. Por esta razón, analizaremos si los promastigotes y amastigotes de Leishmania mexicana ejercen un efecto inhibidor sobre la sintasa inducible del óxido nítrico (iNOS).

El objetivo de este proyecto es analizar la fagocitosis y la sobrevivencia del parásito Leishmania mexicana en las células dendríticas derivadas de monocitos humanos (moDC). La importancia de analizar esto radica en que Leishmania es un parásito intracelular que infecta principalmente macrófagos y células dendríticas y está demostrado que la interacción inicial del parásito con estas células provoca efectos diferentes y estos efectos repercuten en el desarrollo de la enfermedad. Específicamente, se sabe que el parásito en la forma de promastigote es fagocitado principalmente por los macrófagos a través del receptor tres del complemento (CR3) y la infección de estas células por Leishmania provoca la secreción de la citocina IL-10 que es reguladora negativa de la activación del macrófago con lo cual el parásito logra contener los efectos microbicidas de esta célula. Por otro lado, las células dendríticas fagocitan principalmente a los amastigotes a través del receptor para el fragmento Fc de las inmunoglobulinas y la infección de estas células provoca la secreción de la citocina proinflamatoria IL-12 que activa a las células NK para la secreción de IFN-gamma. El IFN-gamma es la principal citocina activadora de los efectos microbicidas de los macrófagos. Lo anterior demuestra que la interacción temprana de Leishmania con los macrófagos o las células dendríticas repercute de manera importante en el desarrollo de la infección. Por esta razón, resulta de gran importancia analizar los receptores que participan en la interacción de los amastigotes y los promastigotes de Leishmania mexicana con las células dendríticas y conocer si el parásito regula a la sintasa inducible del óxido nítrico como una forma de permanecer en estas células. El análisis de la interacción de Leishmania con unas células tan importantes del sistema inmune como lo son las células dendríticas y el papel del parásito sobre los mecanismos microbicidas, poco estudiados de estas células, contribuirá al conocimiento del efecto del parásito sobre la homeostasis del sistema inmune. El conocimiento de la forma como el parásito Leishmania mexicana es fagocitado por las células dendríticas derivadas de monocitos humanos y cómo regula los mecanismos microbicidas de éstas permitirá analizar uno de los aspectos de la sobrevivencia del parásito en estas células, lo cual es de gran importancia en el desarrollo posterior de la enfermedad. _x000D_ Este es el primer proyecto que analizará la interacción de la especie Leishmania mexicana con células dendríticas humanas. Como ya se describió en otras secciones del protocolo, existen otros reportes sobre la fagocitosis de otras especies del parásito Leishmania, pero no de mexicana y se sabe que en este parásito el comportamiento es muy diferente entre las diferentes especies. Este proyecto será también innovador en cuanto al análisis del efecto de Leishmania sobre la sintasa inducible del óxido nítrico de células dendríticas. Se conoce el efecto del parásito sobre este mecanismo microbicida en macrófagos, pero no en células dendríticas. Además, muchos de los reportes que se han hecho con el parásito Leishmania han utilizado la forma de promastigote que es mucho más fácil de cultivar. Nosotros trabajaremos con ambos estadíos para establecer un comparativo entre ambos y será de gran importancia trabajar con la forma intracelular que es el amastigote._x000D_ _x000D_ CONSIDERACIONES ÉTICAS:_x000D_ _x000D_ Este proyecto se realizará con células dendríticas derivadas de monocitos de sangre periférica humana. Esto se hará con el objetivo de trabajar con las células del hospedero natural más importante del parásito que es el hombre. Los monocitos se obtendrán de paquetes celulares “buffy coats” de donadores sanos que amablemente nos donan del banco de sangre del Centro Médico Nacional Siglo XXI, IMSS. Estos paquetes celulares nos los han donado desde hace varios años y representan generalmente material de desecho posteriormente a la obtención del plasma. Es por esta razón que no contamos con cartas de consentimiento de los pacientes. Los paquetes celulares son analizados cuidadosamente antes de su donación para las diferentes enfermedades de transmisión sanguínea tales como hepatitis, HIV, VDRL y únicamente los utilizamos una vez que nos indican que las pruebas resultaron negativas. Los buffy coats se utilizan bajo óptimas condiciones de esterilidad cuidando siempre la seguridad de los alumnos. _x000D_