Actualmente las proteínas glicosiladas recombinantes (GR) son usadas en la terapéutica de un gran número de enfermedades por lo que el interés en sus bioprocesos y biosíntesis es creciente al igual que su demanda. Alrededor del 50% de las GR comerciales son producidas en células de mamífero, pues realizan modificaciones postraduccionales altamente similares a las que presentan las proteínas endógenas humas, lo que mantiene la eficacia de los productos [1]. Particularmente, 70% de las GR comerciales producidas, son biosintetizadas en células de ovario de Hámster Chino (CHO) por su alta productividad, su conocimiento a nivel industrial y su bioseguridad en la salud humana [2]. Sin embargo, los bioprocesos actuales poco productivos e insuficientes para cubrir la creciente demanda de las GR terapéuticas, además de ser costosas [3,4]. Por lo que mejoras en los rendimientos productivos repercutirán en una disminución significativa del costo y la ampliación en su cobertura de uso. Para mejorar los bioprocesos se han desarrollado nuevas estrategias de cultivo, como por ejemplo disminuir la temperatura a condiciones de hipotermia moderada (28ºC-34ºC). En la mayoría de bioprocesos con cambio de temperatura después de alcanzar una buena concentración celular de 37 a 28ºC-34ºC (cultivos bifásicos), la productividad específica y volumétrica aumenta, se prolonga la vida de los cultivos, disminuye el consumo de glucosa y glutamina, y disminuye la actividad de proteasas y sialidasas [5,6,7]. Sin embargo, el mecanismo que envuelve el aumento en la productividad de las GR en estos cultivos bifásicos aún no han sido completamente dilucidados [6]. _x000D_ La transcriptómica y la proteómica en conjunto han servido para identificar y comprender mecanismos biológicos en algunos bioprocesos [8,9]. Hasta ahora, pocos estudios transcriptómicos o proteómicos, no duales, se han realizado para caracterizar el efecto de la hipotermia moderada sobre la producción de GR. En estudios previos, demostramos el aumento de la productividad específica de activador de plasminógeno tisular (tPA) recombinante de 2.6 veces en células TF70R crecidas en matraces agitados en cultivos bifásicos [10]. De ahí que en este proyecto se proponga hacer un estudio transcriptómico y proteómico del efecto del cambio de 37ºC a 30ºC en cultivos bifásicos de la línea CHO-TF70R, para comprender la respuesta orquestada que favorece la productividad de tPA recombinante. Aunque diferentes cuellos de botella afectan la productividad específica como viabilidad celular, el ciclo celular, la activación de apoptosis entre otros, nosotros nos enfocaremos a la comprensión del procesamiento en la vía de secreción, modificación postraduccional, hasta la activación de la respuesta de proteína mal estructurada pues es también es un paso limitante del rendimiento [3, 4]. La interrogante propuesta es un objetivo importante de la biotecnología farmacéutica en el mundo, pues la información que se generará permitirá identificar un conjunto de genes candidatos para ser modificados con la finalidad de hacer la biosíntesis más eficiente a 37ºC y para proponer nuevas estrategias de cultivo._x000D_

En la actualidad se requiere la generación de bioprocesos con líneas de células de mamífero en los que se produzcan altas concentraciones de glicoproteínas recombinantes (GR) terapéuticas seguras, inocuas y efectivas. Ya que la demanda de biofármacos alrededor del mundo incrementa para el tratamiento de múltiples enfermedades crónicas, degenerativas y deficiencias hereditarias. Hasta ahora los tratamientos con dichos biofármacos son costosos y tan solo un pequeño porcentaje de la población tiene acceso a ellos. Por lo que se necesita, del entendimiento de la fisiología celular y de las respuestas celulares regulan la biosíntesis de GR, así como las limitaciones del sistema celular para eliminar los cuellos de botella que limitan la producción de altas cantidades de GR, para hacer estas proteínas económicamente viables. _x000D_ Particularmente, las GR terapéuticas aprobadas para uso humano, son producidas en células de mamífero, principalmente en las de ovario de hámster chino (CHO). Dichas células son usadas pues realizan modificaciones postraduccionales complejas como lo es la glicosilación, aunque su gran desventaja es su baja productividad. En la búsqueda de mejorar rendimientos y productividades, se han manipulado diferentes parámetros de cultivo, que generan respuestas celulares y moleculares, que generalmente no son estudiadas. El conocimiento de la biología de las líneas celulares bajo condiciones productivas y las respuestas celulares, es fundamental para garantizar la seguridad de glicoproteínas en la terapia, y sobre todo para proponer estrategias de cultivo o cambios con ingeniería genética, que mejoren las productividades. Una de las estrategias novedosas que aumentan la productividad específica de algunas GR es la disminución de la temperatura en cultivos de dos fases de temperatura, al inicio a 37ºC y después se mantiene el cultivo en condiciones de hipotermia moderada (28ºC-34ºC). _x000D_ En un trabajo previo, caracterizamos que la línea celular CHO-TF70R recombinante productora de activador de plasminógeno tisular (tPA) cultivada en condiciones bifásicas con cambio de temperatura a las 48 h, de 37ºC a 30ºC, aumentó 2.6 veces su productividad específica [10]. Por otro lado, identificamos que línea celular CRL-12444 recombinante crecida en cultivos bifásicos con cambio a las 72 h de 37ºC a 32ºC, aumentó 30% la productividad específica del anticuerpo anti-IL-8. Posteriormente, se realizó un análisis transcripcional que mostró el aumento de transcritos de proteínas que realizan modificaciones postraduccionales en el RE como glicosiltrasnferasas, glicosil trasnferasas y glicosidasas en el Golgi, así como de la chaperona Bip y de la foldasa PDI del RE asociadas al inicio de UPR, lo que podría sugerir una correlación con el aumento de la productividad específica [46]. Con la necesidad de enmarcar nuestros resultados previos con un entendimiento global del efecto del cambio de temperatura sobre las respuestas moleculares, comenzamos un análisis transcriptómico por secuenciación masiva de las células CHO-TF70R cultivadas en condiciones de hipotermia moderada en cultivos bifásicos. Se obtuvieron muestras de RNA de cultivos en lote a las 0 h, 24 h y 48 h después del cambio de temperatura de 37ºC a 30ºC. Se analizó la expresión diferencial de los transcritos a las 24 y 48 h con respecto al tiempo inicial (0h), usando el método NOIseq. Se corroboró el efecto del cambio de la temperatura con la sobreexpresión del gen rbm3, asociado al estrés por frío. El gen codificante para tPA no presentó cambios significativos. Se determinó la represión de genes codificantes para proteínas del ciclo celular y relacionados con la traducción en ambos tiempos. Los genes expresados diferencialmente fueron los codificantes para proteínas de control en el retículo endoplásmido (RE) como el gen hspa5, que codifica para la chaperona Bip, importante en el plegamiento y el control de la respuesta de estrés en el RE. Los genes codificantes para calreticulina y EDEM, proteínas importantes en el control de calidad en el RE como el foldeo y los determinates para la degradación, fueron sobreexpresados, así como aquellos codifiantes para clatrina, Ocrl, Lrp1 y Wipi1 que hacen parte del ensamble de vesículas. La variación en la expresión de éstos genes indica que la hipotermia moderada afecta la expressión de genes codificantes para proteínas involucradas en la traducción, ciclo celular y en la vía de secreción, posiblemente debido al aumento en la proteína recombinante, el cual debe de requerir un reareglo en la maquinaria responsable de la estructuración y control de calidad en el RE, tráfico de glicoproteínas en el Golgi y su secreción mediante vesículas. _x000D_ _x000D_ De ahí que en este proyecto propongamos continuar con los estudios transcriptómicos y realizar estudios proteómicos de las células TF70R crecidas en cultivos bifásicos de temperatura con cambio de 37 a 30ºC después de 48 h. Además se pretende hacer análisis proteómicos de organelos asociados a la vía secretoria clásica como el RE, Golgi y vesículas, responsables de la secreción de tPA. Los análisis duales de transcriptómica y proteómica, junto con análisis de compartimentos celulares nos permitirán contribuir con información de las funciones y respuestas celulares a nivel molecular, que suceden al someter células CHO al cambio de temperatura y su influencia en el aumento productividad de tPA. Además podremos demostrar la hipótesis de que la hipotermia moderada en cultivos bifásicos favorece la eficiencia de los procesos del plegamiento, transporte y secreción a 30ºC, comparado con cultivos a 37ºC. En cumplimiento del último objetivo propuesto se pretende identificar genes candidatos para ser modificados en células CHO con la finalidad de hacer la biosíntesis más eficiente a 37ºC. Particularmente nos enfocaremos a estudiar las modificaciones en las enzimas de la vía de glicosilación y algunos de los transportadores de glicanos, proteínas cargo de vesículas, proteínas residentes de los compartimentos ER y Golgi, así como las proteínas involucradas con la respuesta de proteína mal estructurada. _x000D_ _x000D_ Una contribución adicional es en área clínica ya que se ha observado la eficacia de las temperaturas alrededor de los 30ºC para la conservación de tejidos dañados como pulmón, miocardio y cerebro, para proteger a las células de su deterioro durante los tratamientos de inflamación [17]. De ahí que este tipo de este tipo de análisis podrían ser usados para hacer comparaciones o ser la base para otros estudios. _x000D_