El trabajo que hemos desarrollado en los últimos años en nuestro laboratorio indica que las toxinas Cry deben su especificidad a las interacciones con proteínas que solo se encuentran presentes en el intestino de los insectos susceptibles. Previamente hemos descrito el papel del receptor caderina en el proceso de oligomerización de estas proteínas, habiendo sido los primeros en demostrar este importante proceso dentro del mecanismo de toxicidad. Estos resultados dieron paso al diseño de toxinas con capacidad de oligomerizar más eficientemente y sin la presencia de este receptor, lo cual ha resultado muy ventajoso porque estas toxinas ahora son tóxicas contra insectos que habían ganado resistencia a las toxinas silvestres. Actualmente estamos caracterizando la interacción de las dos conformaciones estructurales de las toxinas Cry1A’s: la de Monómero y la de Oligómero con sus receptores naturales en el lepidóptero Manduca sexta como insecto modelo. Estos estudios serán la pauta para el desarrollo y diseño de nuevas toxinas con nuevas propiedades para hacerlas más eficientes en su uso en el control de insectos; pero de manera más trascendente, abren también la posibilidad de entender cómo los insectos pueden generar resistencia hacia estas toxinas y prevenirla. En este mismo sentido, el interés de este proyecto se concentra en describir papel, en el mecanismo de especificidad, del Dominio III de 2 toxinas Cry1 que tienen poca identidad a nivel de secuencia de aminoácidos. A pesar de que estudios indican que este dominio tiene un papel importante en la especificidad y toxicidad no se ha explorado que regiones del mismo son determinantes de estas propiedades. Los estudios que se tienen a la fecha datan de los 90’s y desde entonces este Dominio ha sido muy poco estudiado, la comprensión de su función será de gran valor dentro de la biotecnología de estas toxinas. Para generar esta información proponemos investigar más sobre la interacción de las toxinas Cry1Ab y Cry1C con los receptores del lepidóptero Manduca sexta, pero utilizando proteínas separadas en geles de 2 dimensiones que nos permitan evaluar el mayor número de interacciones presentes. A la fecha, hemos estudiado la interacción toxina-receptor en geles de una dimensión y hemos estudiado las interacciones con tres receptores pero no descartamos la participación de otras proteínas. Por otro lado, el caso de la toxina Cry1C es más importante porque no se sabe cuáles son sus receptores en este insecto, estos resultados en su conjunto podrán extrapolarse a otros insectos lepidópteros susceptibles a estas toxinas favoreciendo su posible modificación para incrementar su acción tóxica. Al mismo tiempo se realizará mutagénesis sitio-dirigida sobre 2 regiones discretas del Dominio III que hemos descrito previamente como posibles regiones de interacción con los receptores de Manduca sexta, estas mutaciones nos brindarán información sobre el papel de este dominio en la especificidad ya que compararemos 2 toxinas con toxicidad hacia Manduca sexta y al definir que aminoácidos son importantes en cada toxina, esperamos que algunos cambios aumenten toxicidad o la disminuyan y dependiendo de estos fenotipos, evaluaremos las interacciones de dichas mutantes con los receptores que hemos logrado clonar y expresar heterólogamente empleando la tecnología de SPR, la cual permite una caracterización en tiempo real de interacciones proteína-proteína y obtener los valores de afinidad, lo cual también nos servirá de base para nuevas mutaciones con propiedades mejoradas. En este sentido vamos a clonar la fosfatasa alcalina, de la cual no se conoce aún la secuencia, pero empleando una base de datos de EST’s de un grupo en Inglaterra y mediante 5’y 3’ RACE esperamos realizar la clonación y expresión de esta proteína para la caracterización Bioquímica de nuestras mutantes.

Las toxinas Cry producidas por Bacillus thuringiensis están compuestas por tres dominios estructurales, de los cuales, el Dominio I y II se han estudiado y caracterizado exhaustivamente; sin embargo muy pocos estudios se han realizado sobre el Dominio III a pesar de que varios resultados indican su importancia en la especificidad de estas proteínas. Esperamos con este estudio generar algunas mutaciones sobre este Dominio, de 2 toxinas Cry1, que nos indiquen regiones importantes para la toxicidad y la especificidad, y de este modo comprender y describir mejor el papel de este dominio. También identificaremos los receptores para la toxina Cry1C, los cuales no se han descrito; esta es una toxina con potencial de uso biotecnológico, ya que tiene actividad contra insectos de importancia económica, por lo que si logramos identificar sus receptores podremos diseñar algunas mutaciones que favorezcan su actividad insecticida.