La amplia distribución de las hidrofilinas en los seres vivos, la elevada conservación evolutiva de algunas hidrofilinas vegetales, el conocimiento reciente sobre la función de estas proteínas que revela su papel en la adaptación de las plantas a la limitación de agua y, el hecho de que aún desconocemos aspectos claves de su función, evidencia la importancia de continuar investigando sobre la función de estas proteínas y sus mecanismos de acción, que es el objetivo central de esta propuesta._x000D_ Las características intrínsecas de las hidrofilinas hacen de este grupo de proteínas un tema de estudio interesante desde el punto de vista biológico; ya que, estas proteínas constituyen un grupo único con características fisicoquímicas particulares cuya acumulación se encuentra íntimamente asociada a condiciones de limitación de agua. _x000D_ En este proyecto se proponen dos grandes objetivos: (1) La caracterización estructural de hidrofilinas vegetales pertenecientes a las proteínas LEA de los grupos 4 y 6 y (2). El análisis funcional de estos grupos de proteínas LEA siguiendo estrategias in vitro e in vivo. Con las siguientes metas: (a) Determinar su organización estructural por dicroísmo circular (DC) (LEA 4) y, en el caso de proteínas del grupo 6 continuar esta caracterización, y determinar posibles modificaciones postraduccionales. (b) Determinar el efecto de las modificaciones postraduccionales sobre su organización estructural (LEA 6). (c) Determinar su organización estructural por DC bajo diferentes condiciones de disponibilidad de agua y amontonamiento molecular. (d) Determinar el efecto de cationes divalentes sobre la organización estructural por DC. (e) Determinar la relevancia de los dominios presentes en las proteínas LEA del grupo 4 en su organización estructural utilizando variantes naturales con y sin alguno de estos dominios. (f) Ensayos in vitro de deshidratación parcial y ciclos de congelamiento-descongelamiento, con los que se ha validado la capacidad de la proteína AtLEA4-5 de proteger actividades enzimáticas, nos permitirán analizar la participación de las dos regiones que caracterizan a las proteínas del grupo 4 en su función protectora. Así mismo, se investigará la relevancia funcional de la posible unión a cationes divalentes. (h) La sobre-producción de la proteína AtLEA4-5 en plantas de Arabidopsis confiere una mayor tolerancia a déficit hídrico, durante la germinación y, por otro lado, la falta de esta proteína da lugar a un fenotipo de susceptibilidad ante estas condiciones de estrés. Esto permitirá abordar in vivo la participación de los dos dominios distintivos en esta familia de proteínas en su capacidad de conferir tolerancia al déficit hídrico, o bien de complementar la ausencia de la proteína silvestre; así como, la función de los residuos de histidina con el análisis de los mismos fenotipos. Análisis similares se llevarán a cabo para la proteínas LEA 6, para las que una mutante de pérdida de función en uno de los genes de esta familia presenta un fenotipo de susceptibilidad al déficit hídrico durante la germinación y a salinidad en la fase vegetativa. Estos nos permitirá determinar si proteínas mutantes en los residuos de interés, los más conservados en este grupo, son capaces de complementar tal función._x000D_

Como se menciona en la sección de antecedentes uno de los objetivos de mi grupo de trabajo es lograr dilucidar la función y el mecanismo de acción de las proteínas denominadas hidrofilinas, entre las que se encuentran las proteínas LEA. La información que hemos generado y la reportada en la literatura nos ha permitido establecer hipótesis de trabajo en las que proponemos que los motivos conservados en cada familia están involucrados en el reconocimiento de sus moléculas blanco, o bien, en la adquisición de alguna estructura apropiada para su función bajo ciertas condiciones ambientales; bajo este esquema, éstas regiones les permitirían a estas proteínas adoptar una estructura más estable, en tanto que las regiones “no estructuradas” o “flexibles” de la proteína corresponden a aquéllas que estarían implicadas en asociarse con mayor afinidad al agua para proporcionar un microambiente con la cantidad de agua adecuada que le permita a sus moléculas blanco, y a ellas mismas, mantener su funcionalidad (1). El hecho de que el análisis global de estas proteínas revele que la gran mayoría de ellas son proteínas “intrínsicamente no estructuradas” (INE) sugiere que esta propiedad se encuentra asociada a su mecanismo de acción, de tal forma que hemos propuesto que ésto les daría la flexibilidad para reconocer a sus blancos sin dejar de desplegar sus aminoácidos hidrofílicos y unir agua. _x000D_ Bajo esta hipótesis de trabajo, el presente proyecto contribuiría no sólo a la caracterización de este grupo de proteínas sino que también proporcionaría las bases para entender la función y el mecanismo de acción de proteínas INEs (PINEs) en plantas para las cuales la información es muy escasa._x000D_ Cabe mencionar que el organización estructural de las PINEs se ha descrito como conjuntos fluctuantes de conformaciones alternativas. Esta característica presenta a las PINEs como moléculas con la plasticidad suficiente como para adoptar diferentes estructuras en diferentes ambientes o con diferentes blancos (2, 3). El estudio de estas proteínas en animales y bacterias ha permitido asignarles algunas funciones; por ejemplo se ha encontrado que algunas funcionan como cadenas entrópicas; es decir, que pueden actuar como resortes moleculares (i.e., dominio PEVK de titina). Otras funcionan como chaperonas de RNA o de proteínas al ayudar a moléculas de proteínas y/o RNAs en la adquisición de un plegamiento funcional (i.e., proteína de respuesta a frío (Csp) de Bacillus subtilis). También se han descrito como proteínas efectoras, de tal forma que modulan la actividad de su molécula blanco (i.e., PKI inhibe la proteína quinasa dependiente de AMPc), o como proteínas señalizadoras (i.e., p53 que transluce señales hacia diferentes vías dependiendo del blanco con el que interactúa). También las hay que actúan como proteínas ensambladoras de complejos proteícos (i.e., caldesmon es una INE involucrada en la polimerización de actina); o bien como secuestradoras, ya que atrapan o neutralizan ligandos pequeños (i.e., la caseína inhibe la precipitación de fosfato de calcio en la leche), etc. (4). La capacidad de muchas de estas proteínas para reconocer diferentes ligandos sin perder su especificidad habla de su versatilidad y de la posibilidad de que una proteína con estas características pueda realizar más de una función._x000D_ En este contexto, resulta relevante el estudio de PINEs en plantas en donde realmente sabemos casi nada sobre las funciones que llevan a cabo y aún menos de los mecanismos implicados en ello. Así pues las hidrofilinas y, en particular, las proteínas LEA se presentan como un paradigma de PINEs en plantas, dado que los datos obtenidos hasta ahora sugieren que poseen cierta plasticidad estructural que les permitiría reconocer un número relativamente diverso de blancos biológicos sin perder su especificidad. Adicionalmente, la información obtenida es indicativa de que las condiciones del medio ambiente podrían también afectar su conformación, de tal forma que esto podría influir en su función y/o en la selección/interacción con sus blancos (1,5,6,7). Este último escenario plantea una pregunta que no ha sido abordada en otros organismos y, que resulta evidente para las hidrofilinas que generalmente se acumulan bajo condiciones de limitación de agua o de un alto amontonamiento molecular (1). _x000D_ Puesto que la posibilidad de que, si no todas, la mayoría de las proteínas LEA posean una estructura desplegada en solución acuosa indique que estas proteínas llevan a cabo su función a través de un mecanismo de acción común, refuerza la importancia de estudiar y con ello contribuir al esclarecimiento de la función de algunas de ellas, como proponemos en este proyecto._x000D_ _x000D_ _x000D_ 1. Olvera-Carrillo Y, Reyes JL, Covarrubias AA (2011) Plant Signal Behav 64: 1-4 _x000D_ 2. Tompa P (2002) Trends Biochem Sci 27: 527-33._x000D_ 3. Dyson HJ, Wright PE (2005) Nat Rev Mol Cell Biol 6: 197-208._x000D_ 4. Tompa P (2005) FEBS Lett 579: 3346-54._x000D_ 5. Wolkers F, Bochicchio A, Selvaggi G, Hoekstra FA (1998) Plant Physiol 116: 1169-1177_x000D_ 6. Goyal K, Tisi L, Basran A, Browne J, Burnell J, Zurdo J , Tunnacliffe A (2003) J Biol Chem 278: 12977–12984_x000D_ 7. Dahr A, Samiotakis, Ebbinghaus S, Nienhaus L, Homouz D, Gruebele M, Cheung MS (2010) Proc Natl Acad Sci USA 107: 17586-17591._x000D_ _x000D_ NOTAS ADICIONALES:_x000D_ En esta propuesta en el rubro de Actividades Académicas sólo se incluyen las actividades a realizar durante el año 2012, dada la dificultad de contar con la información para años posteriores._x000D_