Las toxinas (Txs) Cry de Bacillus thuriengiensis son proteínas con actividad insecticida que se han empleado para el control de plagas de insectos. Estas Txs tienen su efecto al formar poros iónicos en la microvellosidad del epitelio intestinal. El poro formado tiene escasa selectividad iónica que genera un desbalance osmótico provocando la muerte de la célula. Nosotros hemos caracterizado electrofisiológicamente esta actividad tanto en membranas de epitelio como en membranas modelo, demostrando que la actividad es dependiente del correcto procesamiento y formación del oligómero._x000D_ _x000D_ En el caso de Txs formadoras de poro (TFP) con actividad en mamífero se ha analizado la respuesta celular empleada para subsanar el daños en membrana generado por la Tx. En el caso de aerolisina, alfatoxina, listeriolisina O, neumolisina y hemolisina se reporto la activación de vías de señalización como apoptosis, proliferación, sobrevivencia, respuestas tipo inflamatorias y autofagia, respectivamente, en función de la concentración de Tx y tipo celular empleado. En otros experimentos el análisis celular se realiza durante el tiempo que la célula se recupera del daño transitorio, luego de que la toxina se retiro minutos despues de su aplicación, En estos estudios algunas cinasas activadas por mitógeno (MAPKs) cambian sus patrones de fosforilación, entre ellas; ERK1/2, JNK pan, MEK1/2, MSK1/2, CREB, eIF2alfa, AMPKalfa, GCN2 y p38. Lo interesante de esta caracterización es que para todos los casos la respuesta intracelular y fosforilación es dependiente del flujo de K+. Por lo que se ha propuesto a K+ como el regulador maestro de la respuesta general de la célula a daño por TFP, sin saberse como puede ejercer su efecto._x000D_ _x000D_ Para las Txs Cry la respuesta celular no se ha analizado. Existen reportes sobre larvas de Aedes aegypti y Manduca sexta expuestas a concentraciones subletales mostraron cambios en niveles de la expresión de P38 e hipersensibilidad en larvas tratadas con RNAi de p38. Por otro lado, la toxina Cry5Aa en el nematodo C. elegans activa una vía de respuesta celular que involucra p38, SEK-1 y JNK. En una línea celular expresando heterólogamente al receptor caderina se sugiere que la respuesta es de muerte necrotica dependiente de Mg2+ y adenilil ciclasa/PKA._x000D_ _x000D_ Nosotros analizaremos la respuesta celular inducida por Cry1Ab en la línea celular Cf-1 (lepidóptero) que es sensible a la Tx. Nuestra hipótesis es que K+ iones actúa como regulador maestro al cambiar su gradiente electroquímico y activar las bombas ATPasas Na+-K+ y la de Ca2+. Esto cambia la relación ATP/AMP y activa AMPka2. Además un mecanismos de regulación por contacto directo de la ATPasa Na+-K+ sobre la cinasa Src se ha reportado recientemente. Src es un regulador de la vía de activación de ERK1/2 y al igual que AMPKa2 su fosforilación es dependiente del eflujo de K+ en respuesta a TFP._x000D_ _x000D_ El análisis de la respuesta celular será global: 1)analizando cambios intracelulares de pH, Ca2+, K+, Na+ mediante adquisición de imagen por epifluorescencia con indicadores fluorescentes y resolución temporal, 2)Establecimiento de patrones de fosforilación de las MAKPs referidas arriba, mediante “western blot” con anticuerpos comerciales, 3)Empleo de inhibidores y activadores de vías de señalización previamente reportadas en respuesta a TFP así como de la ATPasa NA+-K+, para estudiar cambios de sensibilidad a la Tx que permitan sugerir una participación de la vía.

El conocimiento sobre el modo de acción de las toxinas Cry ha permitido entender los pasos fundamentales para que la toxina logre su efecto en las células blanco. Esta información se ha empleada para el desarrollo de nuevas toxinas que puedan ser mas toxicas y para el desarrollo de toxinas modificadas que han logrado matar a larvas resistentes a las toxinas silvestres, entre otras aplicaciones. También ha ayudado al diseño de mejores construcciones genéticas para la expresión de la toxina en plantas recombinantes. No hay duda que el conocimiento generado alrededor de este mecanismo ha contribuido significativamente en la aplicación biotecnológica de esta toxinas Cry. Continuar entendiendo el modo en que las toxinas bacterianas interaccionan con las células ayudara ha encontrar blancos moleculares indirectos de las toxinas Cry que aún desconocemos y que al encontrarlos pueden ayudar a explicar la existencia de poblaciones resistentes a las toxinas que aún no se han logrado genotipicar y el diseño de estrategias que permitan hacer vulnerables esos nuevos blancos. En contra parte, este proyecto aborda una área dentro de la fisiología de las células sensibles, al intentar responder como la célula logra sobre ponerse al efecto de las toxinas Cry y considerar la caracterización de un mecanismo probablemente general de respuesta al daño de membrana por poros iónicos. En este contexto la información presente en el campo mediante TFP con blanco en mamífero esta marcando la pauta, sin embargo, aun no se ha definido el mecanismo por el cual el ión K+ puede ser un regulador maestro de la respuesta. Nuestra propuesta plantea indagar en esa pregunta general y propone como entidad molecular responsable de la transducción de señal del eflujo de K+ a la ATPasa Na+-K+ mediante una vía que involucra activación de MAPK. Sin duda la contribución del trabajo puede ser de impacto en las dos áreas que planteamos (El mecanismo de acción de las toxinas Cry y la función del ión K+ como señalizador celular._x000D_ _x000D_ Durante el desarrollo del trabajo se incorporará un estudiante de Doctorado ya definido que presenta ingreso este semestre y 2 estudiantes de maestría. Los resultados obtenidos se presentaran en tres congresos nacionales y dos Internacionales se espera se logre publicar por lo menos dos artículos con arbitraje internacional.