Las cascadas de cinasas de proteínas activadas por mitógenos (MAPK, por sus siglas en inglés) constituyen vías de transducción de señales altamente conservadas en todos los organismos eucariotes. Un módulo de MAPKs consiste de al menos tres cinasas que se activan (fosforilan) de manera secuencial y específica. Inicialmente una MAPKKK, a su vez generalmente activada por un receptor, fosforila a una MAPKK que entonces activa a una MAPK, la cual constituye el último componente del módulo, pero que su vez es capaz de fosforilar varios sustratos entre los que se incluyen factores de transcripción que impactan, de manera positiva o negativa, la expresión génica. Particularmente en plantas, esta secuencia de fosforilación de proteínas trabaja coordinadamente para regular un amplio rango de procesos biológicos, como son las respuestas a estrés biótico y abiótico, la percepción y actividad de hormonas y diferentes programas del desarrollo. _x000D_ La redundancia funcional es una característica común de la MAP cinasas a todos los niveles. Sin embargo, ha sido reportado que mutaciones en el gen MAPK6 de Arabidopsis thaliana, resultan en defectos severos en el desarrollo del embrión (Bush & Krysan, 2007) y las raíces (Müller et al, 2010), lo que indica que, al menos en esos programas de desarrollo, la función de esta enzima no puede ser totalmente suplementada por ninguna de las otras 19 isoformas que están codificadas en el genoma de esta planta. _x000D_ Mediante un cuidadoso examen fenotipo de dos alelos nulos independientes de mapk6 (Fig.1), nosotros hemos establecido que los fenotipos de embrión y raíz están estrechamente relacionados y que realmente corresponden a un fenómeno genético de penetrancia/expresividad, con semillas explotadas (SE)/no raíz (NR) y semillas pasitas (SP)/raíz corta (RC), representando los fenotipos fuertes y débiles, respectivamente (Fig. 2) (López-Bucio et al, en Preparación). El fenotipo SE (~7% en ambas líneas analizadas), generalmente produce plántulas sin raíz incapaces de desarrollarse y que terminan por morirse (Fig. 3), pero eventualmente algunas de estas plántulas sin raíz desarrollan raíces adventicias (Fig. 4) que les permiten completar su desarrollo y producir progenie, en la que los fenotipos descritos segregan en las mismas proporciones. Por su parte, el fenotipo SP (25 % en ambas líneas bajo estudio), siempre resulta en plántulas viables con RC (Figs. 6 y 7) (López-Bucio et al, En Preparación). Dada la naturaleza modular de las cascadas de MAP cinasas, uno de los principales objetivos de este proyecto consiste identificar componentes río arriba y río abajo de MAPK6, para lo cual se usará una combinación de estrategias genéticas, basada en el escrutinio de mutantes que presenten fenotipos similares, bioquímicas y moleculares, mediante el análisis del efecto de diferentes fitohormonas sobre el crecimiento de raíz y el establecimiento de los patrones de expresión a nivel de transcritos y proteínas complementados con ensayos de actividad de algunos de los genes y proteínas bajo estudio, y bioinformáticas, a través de análisis in silico para la búsqueda de mutantes en proteínas reportadas para ser sustratos de MAPK6. _x000D_ Por otro lado, de manera interesante nuestros resultados preliminares indican que el fenotipo de RC de la mutante mpk6 está asociado con un meristemo radical reducido y un incremento en el desarrollo de pelos radicales en la zona de transición de la raíz (Fig. 8). Dado que el meristemo y la zona de transición de la raíz, han sido reportados como el lugar de máxima actividad del promotor del gen MAPK6 (Müller et al, 2010), nosotros especulamos que esta enzima puede funcionar como un regulador negativo del programa de desarrollo de pelos radicales. De tal manera, otro de los objetivos de este proyecto está enfocado a evaluar esta posibilidad usando una estrategia genética, enfocada al análisis fenotípico de la progenie de cruzas dirigidas entre la mutante mpk6 y mutantes de las cinasas MAPKK y MAPKKK con fenotipos similares identificadas en este estudio, con líneas reporteras marcadoras del desarrollo de la raíz, como CQ25::GUS (Sabatini et al, 2003), scarecrow::GFP (Wysocka-Diller et al, 2000), actividad mitótica, como ciclina B1::GUS (Colon-Carmona et al, 2009) y 2HB::YFP (Boisnard-Loring et al, 2001) y del efecto de reguladores del crecimiento sobre este programa de desarrollo, como es el caso de proporz::GUS (Sieberer et al, 2003) y DR5::GUS (Ulmasov et al, 1997)._x000D_ Simultáneamente, con la idea de determinar cuales reguladores del crecimiento vegetal podrían ser responsables de los defectos en el desarrollo de la raíz mostrados por la mutante mpk6, se plantea una estrategia bioquímica/farmacológica para probar el efecto de auxinas, citocininas, ácido jasmónico, ácido salicílico, etileno, ácido abscísico, ácido giberélico, alcamidas y óxido nítrico, sobre los fenotipo de raíz. Estos estudios serán complementados incluyendo en el análisis tanto mutantes de las cinasas río arriba de MAPK6 identificadas, como líneas marcadoras sobre fondos genéticos mutantes._x000D_ A la fecha, usando microscopia confocal nosotros hemos propuesto que los defectos en el embrión que resultan en el fenotipo SE/NR, aparentemente provienen de una división longitudinal anormal que tiene lugar en la célula más apical del suspensor (Fig. 5), cuyo destino final es conformar el centro quiescente del meristemo radical (López-Bucio et al, En Preparación). Para profundizar en este estudio, se analizaran diferentes etapas del desarrollo embrionario en la progenie de cruzas dirigidas entre la mutante mpk6 y mutantes de las cinasas MAPKK y MAPKKK con fenotipos similares identificadas en este estudio, con líneas marcadoras del desarrollo del embrión como son ABI4::GUS (Soderman et al, 2010), WOX5::GFP (Billow et al, 2005) y scarecrow::GFP (Wysocka-Diller et al, 2000). _x000D_ Como productos del proyecto en cuanto a la formación de recursos humanos, se contempla la titulación de un estudiante de maestría, quien ya colabora actualmente en e proyecto, la incorporación y titulación de al menos dos estudiante de licenciatura y la participación de un estudiante de doctorado y otro estudiante de postgrado (maestría o doctorado). En cuanto a publicaciones, se esperan generar datos novedosos y suficientes para dos artículos internacionales en revistas con arbitraje. Finalmente, los avances de nuestra investigación se piensan presentar y discutir ante la comunidad científica nacional e internacional, en al alrededor de seis reuniones académicas a lo largo de los tres años planeados para su desarrollo y culminación.

Este es un proyecto que debe ser considerado como de investigación en ciencia básica, de manera que su principal contribución se espera que sea la generación de nuevo conocimiento en el campo de estudio (bioquímica y biología molecular de plantas) al que pertenece. Dicho conocimiento deberá ser puesto a disposición de la comunidad científica a través de la publicación de resultados en artículos en revistas internacionales de prestigio y la presentación de avances en reuniones académicas nacionales e internacionales. De manera paralela, también deberá contribuir a la formación de recursos humanos de alto nivel académico a través de la participación y graduación de estudiantes de licenciatura y postgrado. _x000D_ _x000D_ A este respecto, el cumplimiento de los objetivos del proyecto parecen ser adecuados para generar datos suficientes para la publicación de al menos dos artículos internacionales y garantizar la asistencia de los estudiantes y/o investigadores participantes a diferentes reuniones académicas. En el caso de estudiantes, es importante resaltar que su participación en congresos y simposios es una hecho que impacta favorablemente su formación académica._x000D_ _x000D_ En lo referente a la formación de recursos humanos, en el proyecto participa actualmente un estudiante de maestría, quien deberá de graduarse al final del primer año y ya ha manifestado su intención de continuar como estudiante de doctorado. Así mismo, la autorización del presupuesto solicitado permitirá la incorporación de otro estudiante postgrado y de un mínimo de dos estudiantes de licenciatura, susceptibles de al mediano plazo continuar participando como estudiantes de postgrado. Los temas de tesis de los estudiantes potenciales están descritos en las metas anuales de la propuesta. _x000D_ _x000D_ En cuanto al planteamiento del proyecto, conviene mencionar que la elucidación de la identidad y función de los componentes de las múltiples vías de transducción de señales que operan para establecer, coordinar y modular los programas de desarrollo, constituye uno de los retos principales de la investigación en biología en lo general y de la biología vegetal en lo particular. Los cada vez más numerosos resultados de investigaciones con enfoques a escala genómica, ha revelado que los mecanismos referidos incluyen la regulación transcripcional y postranscripcional, independiente, simultánea y secuencial de miles de genes. En este sentido, la valiosa información proveniente de dichas investigaciones, ahora debe validarse experimentalmente para genes individuales y/o pequeños grupos de genes que por su naturaleza reguladora pueden ser considerados como importantes puntos de control de una vía de señalización particular. En este escenario, el presente proyecto, dirigido a la elucidación de una cascada de MAP cinasas implicada en el control de los programas de desarrollo de semilla y raíz, así como a la identificación del o los reguladores del crecimiento vegetal involucrados en estos procesos, debe ser considerado con un alto potencial de hacer importantes contribuciones conceptuales al respecto._x000D_ _x000D_ Es una realidad que la función y participación de las enzimas bajo estudio en diferentas vías de transducción ya ha sido demostrada, mediante el uso de estrategias genéticas, bioquímicas y moleculares, como las consideradas en nuestra propuesta. Sin embargo, nuestro planteamiento es novedoso en tanto que a la fecha no se ha reconocido la relación que evidentemente existe entre los fenotipos de semilla y raíz manifestado por la mutante mapk6, en los que se basa nuestro proyecto. De hecho, los fenotipos de semilla y raíz han sido estudiados y reportados de manera independiente, pero en ningún caso se ha establecido ni abordado experimentalmente la intercomunicación que, a través de una cascada de MAP cinasas, claramente existe entre estos dos importantes programas de desarrollo vegetal._x000D_ _x000D_ Para terminar, vale la pena resaltar que actualmente disponemos de materiales biológicos entre los que se incluyen, mutantes para tres diferentes MAPKKKs, para siete de las diez MAPKKs existentes en el genoma de Arabidopsis, para tres MAPKs e incluso para una fosfatasa que regula negativamente a la MAPK6 bajo estudio; anticuerpos policlonales contra MAPK6 y otras dos MAP cinasas (3 y 4); fosfo anticuerpos que permiten la inmunodetección de las formas activas de las MAP cinasas; diez líneas marcadoras de diferentes procesos de desarrollo (ocho de las cuales serán utilizadas en el proyecto); numerosas sondas moleculares para estudios de expresión de varios de los genes bajo estudio, así como herramientas experimentales, como ensayos de fosforilación en gel y de complementación bifuncional de fluorescencia, y equipo como microscopios confocal y de epifluorescia, que aunados al grupo de trabajo y colaboradores, nos ponen en una buena posición para hacer contribuciones importantes en el competido campo de investigación sobre las MAP cinasas de plantas._x000D_