En los últimos doce años mi laboratorio ha investigado el papel de la holocarboxilasa sintetasa (HCS) en el metabolismo y regulación de la expresión genética en células eucariontes. Durante más de 40 años se consideró que la función de la HCS estaba limitada a la regulación de la homeostasis metabólica a través de la biotinilación y activación de las cinco enzimas carboxilasas dependientes de biotina que existen en células humanas. Sin embargo, mi grupo de investigación demostró que la HCS es esencial para la expresión transcripcional de al menos 19 genes en células humanas. El mecanismo responsable involucra la conversión de biotina a biotinil-AMP catalizado por la HCS y la activación de la cascada de transducción de señales compuesta por la guanilato ciclasa sobluble (GCs) y la proteína cinasa dependiente de GMPc (PKG)._x000D_ _x000D_ Recientemente se ha encontrado la presencia de HCS y biotina en el núcleo de células eucariontes en donde se ha especulado podría regular la expresión genética a través de la remodelación de la cromatina mediante la biotinilación de histonas. Sin embargo, diversos grupos de investigación han cuestionado el papel epigenético de la HCS y de la biotina al ser incapaces de demostrar la presencia de esta vitamina en nucleosomas aislados de células en cultivo. Estos trabajos han dejado sin explicación la presencia de la HCS en el núcleo celular. Durante el anterior apoyo PAPIIT mi laboratorio se dedicó a estudiar a la HCS nuclear y para ello decidimos utilizar al embrión de Drosophila melanogaster como modelo experimental. Los resultados obtenidos demuestran que en la mosca la HCS es una proteína asociada a regiones de heterocromatina enriquecidas con marcas epigenéticas de represión transcripcional. Estos resultados nos llevan a proponer la hipótesis de que la HCS regula la expresión genética a través de dos mecanismos diferentes. El primero involucra a la vía de señalización HCS-GCs-PKG y funciona activando la transcripción de genes involucrados en el metabolismo intermediario. El segundo mecanismo requiere de la translocación de HCS al núcleo y su reclutamiento a regiones de heterocromatina en donde participaría en eventos de represión transcripcional y silenciamiento genético._x000D_ _x000D_ En este proyecto proponemos estudiar el papel de la HCS nuclear sobre la expresión genética combinando el uso de células humanas en cultivo y de larvas de Drosphila melanogaster como modelos experimentales. Los experimentos propuestos en esta solicitud tiene el fin de comprobar lo siguiente:_x000D_ _x000D_ 1. Comprobar quela HCS actúa como un represor transcripcional cuando est´situada en un ambiente cromatininco._x000D_ _x000D_ 2. Determinar el mecanismo responsable de la actividad represora de la HCS._x000D_ _x000D_ 3.Estudiar la interacción de la HCS con enzimas desacetilasas de histonas y otros factores involucrados en represión trasncripcional._x000D_ _x000D_ 4. Purificar y caracterizar los complejos proteicos responsables del reclutamiento de la HCS a la cromatina en células humanas y células de glándulas salivales de Drosophila melanogaster._x000D_

En los últimos 12 años mi grupo de investigación se ha convertido en un centro de referencia en el estudio de enfermedades genéticas asociadas a la enzima holocarboxilasa sintetasa y al metabolismo de la vitamina biotina. Mi grupo de investigación ha sido el primero en describir molecularmente los mecanismo por los cuales la HCS media la expresión genética dependiente de biotina de la menos 19 genes en células humanas. Durante los períodos apoyadospor PAPIIT mi grupo ha caracterizado a dos enfermedades humanas: deficiencia múltiple de carboxilasas y deficiencia de biotinidasa y hemos descrito un mecanismo de protección al metabolismo cerebral durante el ayuno o la deficiencia de biotina al que he denominado “altruismo tisular”. _x000D_ _x000D_ Esta solicitud de Donativo PAPIIT propone extender los resultados obtenidos durante el período apoyado por el Donativo PAPIIT IN226609 entre los que cabe destacar los siguientes: Mi grupo desarrollo un nuevo método para el diagnóstico de las enfermedades deficiencia múltiple de carboxilasas y deficiencia de biotinidasa que fue publicado como un artículo original en Molecular Genetics and Metabolism. Es particularmente relevante a esta propuesta el hallazgo de que la enzima HCS es una proteína nuclear asociada a regiones de heterocromatina en cromosomas politenicos de Drosophila melanogaster. Los resultados obtenidos por mi grupo demuestran que la HCS esta asociaa a regiones enriqeucidas con marcas epigenéticas de represión trasncripcional. Al estudiar el dominio Hsp70 encontramos la presencia de HCS e la región promotora de este gen cuando se encuentra transcripcionalemente inactivo. Sin embargo, al activar la transcripción de Hsp70 mediante choque de calor la HCS es desplazada mientras que este dominio se enriquece con RNA pol II y otras proteínas de la maquinaria basal de transcripción. _x000D_ _x000D_ I. LA HCS REGULA LA EXPRESIÓN GENÉTICA A TRAVÉS DE DOS MECANISMO DIFERENTES:_x000D_ _x000D_ En este proyecto proponemos poner a prueba la hipótesis de que la HCS regula la transcripción de genes blanco a través de dos mecanismos diferentes. El primero meanismo es no genómico e involucra la cascada de transducción de señales HCS-GCs-PKG descrita por mi grupo en el pasado reciente. El segundo mecanismo es de naturaleza genómica e involucra el trasnportede HCS a núcleo celular en donde se sitúa en regiones de heterocromatina. E este proyecto estudiaremos el papel de la HCS nuclear com un posible represor transcripcional que requiere del reclutamiento de desacetilasas de histonas y de complejos multipeptídicos represores de la expresión genética._x000D_ _x000D_ En este proyecto pretendemos combinar el uso de células humanas en cultivo y de larvas de Drosophila melanogaster como modelos experimentales para determinar las funciones nucleares de la HCS. Ambos modelos han sido utilizados exitosamente en el pasado por mi grupo de investigación._x000D_ _x000D_ II. EL PAPEL REPRESOR DE LA HCS NUCLEAR NO INVOLUCRA REMODELACIÓN DE LA CROMATINA A TRAVÉS DE LA BIOTINILACIÓN DE HISTONAS._x000D_ _x000D_ Al ser hallada HCS y biotina en el núcleo de diversas células eucariontes, varios grupos de investigación propusieron que la HCS podría regular la exresión genética al modificar la estructura de la cromatina mediante la biotinilación de histonas. Este modelo es muy atractivo desde elpunto de vista experimental ya que no requiere de nuevas funciones o proteínas participantes y solo recurre a una función ya conocdida de la HCS y que ha sido bien caracterizada en el pasado debido al papel que esta proteína juega en la activación de carboxilasas y el metabolismo intermedario. Sin embargo, este modelo deja dos grandes interrogantes: El primero involucra a pacientes deficientes de HCS los cuales se caracterizan por una deficiente biotinilación de carboxilasas dependientes de biotina: este defecto bioquímico da lugar al cuadro clínico y bioquímcio que caracteriza a la enfermedad y que incluye somnolencia, hiperamonemia, aciduria y acidosis orgánica. El origen de todas estas manifestaciones pueden ser rastreado hasta la deficiente actividad de carboxilasas ya que tienen un papel esencial en el metabolismo de carbohidratos , ácidos grasos y amino ácidos. Los resultados de nuestro laboratorio indican que la deficencia de HCS afecta la vía de transducción de señales compuesta por las ezimas HCS-GCs-PKG. Esta vía es la responsable de mantener la transcripción de enzimas involucradas en la utilización de biotina y el metabolismo de ácidos grasos y carbohidratos. Mi laboratorio ha demostrado que la deficiente expresión de estos genes es compatible con el fenotipo que caracteriza a estos pacientes. Sin embargo, aunque la biotinilación de histonas ha sido involucrada en la regulación de numerosos procesos celulares no se ha demostrado quelos mismos estén afectados en células de pacientes con deficiencia de HCS. Este resultado y e hecho de que varios laboratorios como se describe en la sección de antecedentes han fallado en demostrar la presencia de biotina en histonas aisaldas d cultivo celulares han cuestionado e significado biológico de la biotinilación de histonas._x000D_ _x000D_ La principal contribución de este proyecto será el esclarecimiento del papel nuclear de la HCS. Hasta el momento nuestros resultados preliminares indican que la HCS cuando es reclutada a un ambiente cromatinico puede reprimir la transcripción de genes reporteros. Los experimentos propuestos permitirán describir los mecanismos involucrados asi como contestasr si esta nueva función de la HCSrequiere o no de su actividad de biotinilación. Es posible que la HCS nuclear forme parte de un complejo proteíco de represión y silenciamiento genético que no involucra su actividad enzimática y por ello los pacientes con deficiencia en la actividad de biotinilación de la HCS no muestran evidencia diferente del papel de esta enzima y la vitamina biotina en la regulación de la homeostasis metabólica._x000D_ _x000D_ Los resultados obtenidos por mi grupo de investigación no tienen precedente en el estudio del papel de vitaminas hidrosolubles en el metabolismo intermediario. De manera igualmente importante hemos demostrado que la enzima HCS, conservada evolutivamente desde las bacterias hasta el hombre, puede tener un papel en la regulación de la expresión genética único y que ayudará a entender el papel de micronutrientes en eventos como la desnutrición , síndrome metabólico y enfermedades relacionadas al metabolismo de biotina._x000D_ _x000D_ III. FORMACION DE RECURSOS HUMANOS_x000D_ _x000D_ Este proyecto permitirá que mi laboratorio continúe formando recursos humanos de lato nivel. En los últimos 12 años que mi laboratorio ha sido apoyado por recursos PAPIIT se han formado 4 estudiantes de licenciatura, dos de Maestría y cuatro de Doctorado. Entre estos últimos dos de ellos se han incorporado a la actividad científica como investigadores. E el curso del próximo año la alumna Sandra Rauel Reyes Carmona obtendrá el grado de Doctora en Ciencias Biomédicas y al menos otra estudiante, Isis Trujillo, se titulará de Doctorado trabajando en este proyecto. Se han incorporado recientemente dos estudiantes más que están por ingresar al Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas de la UNAM._x000D_ _x000D_ IV. PUBLICACIONES_x000D_ _x000D_ En los últimos cinco años mi laboratorio ha publicado 5 artículos con reconocimiento a PAPIIT. En los últimos 9 años mi laboratorio ha publicado en revistas internacionales de alto impacto que incluyen 1 artículo en Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 2 artículos en Journal of Biological Chemistry, 3 artículos en Molecular Genetics and Metabolism y varios más en otras revistas. _x000D_