Los peptidos contribuyen al funcionamiento y a la plasticidad del sistema nervioso en diferentes escalas temporales. La intensidad y duración de sus acciones depende en parte de la dinámica de los procesos de secreción, de la eficacia de sus mecanismos de activación o inactivación en el medio extracelular, de las propiedades dinámicas de sus receptores y de las vías de transducción que activan._x000D_ El mecanismo más común de inactivación de peptidos en el medio extracelular es por peptidasas ancladas a la membrana plasmática, con su sitio activo frente al medio extracelular (ectopeptidasas). Las aminopeptidasas de la familia M1 de metalopeptidasas tienen varios miembros involucrados en la comunicación intercelular en el cerebro. Esta familia incluye ectopeptidasas como la aminopeptidasa N, la aminopeptidasa A, y la piroglutamil peptidasa II (PPII). La PPII es, a diferencia de muchas otras peptidasas, una enzima de especificidad estrecha, cuyo blanco preferente es la hormona liberadora de tirotropina (TRH), un tripéptido de secuencia pglu-his-proNH2 involucrado en la comunicación intercelular en animales. Hemos obtenido datos que sugieren que la PPII es una enzima fundamental para la inactivación de la TRH en el medio extracelular. Las evidencias criticas incluyen: a) la estrecha especificidad de la enzima, b) la topografía de esta enzima transmembranal, con su sitio activo en el medio extracelular, c) la localización casi exclusiva en neuronas, posiblemente del lado post-sináptico, así como en células gliales especializadas (tanicitos) cuyas extensiones citoplasmáticas entran en contacto con los botones sinápticos de neuronas TRHergicas en la eminencia del hipotálamo, y d) un patrón regulatorio asociado a la actividad neuronal. Además, mas recientemente hemos comprobado con varias herramientas (en particular inhibidores específicos) que la actividad de la PPII efectivamente controla algunos de los efectos del TRH in vivo. En particular, sospechamos que la PPII de tanicitos contribuye a establecer la actividad del eje tiroideo._x000D_ Sin embargo, los papeles de la PPII en el SNC in vivo son todavía poco conocidos. El objetivo general de esta solicitud es obtener información sobre el impacto funcional de la PPII in vivo. Queremos en particular determinar si la PPII es crítica para establecer el nivel de actividad del eje tiroideo, y entender su relevancia en el balance energético. Para esto, 1) analizaremos el fenotipo de ratones “knockout” para la PPII; 2) generaremos un ratón “knockout” condicional para la PPII con sitios Lox orientados en la misma dirección en los intrones 1 y 2; y 3) determinaremos el impacto fenotípico de cruzar estos animales con ratones con expresión de la recombinasa CRE en astrocitos y tanicitos._x000D_ La PPII es de las muy pocas ectopeptidasas con una especificidad tan estrecha. Por lo tanto, esperamos que los cambios fenotípicos sean asociables únicamente a la alteración en la eficiencia de la comunicación TRHergica, o sea al involucramiento de un solo sistema peptidergico en circuitos precisos. Por otro lado, la TRH es un componente de los sistemas centrales de control del balance energético, y datos iniciales sugieren que la PPII participa en estos circuitos. Por lo tanto, los datos del proyecto nos permitirán aclarar si la PPII es un blanco terapéutico potencial para tratar desordenes del balance energético.

Justificación y Contribución del proyecto_x000D_ Nuestro propósito a largo plazo es entender mejor el papel de las ectopeptidasas en la comunicación intercelular, y además analizar si estas son un blanco terapéutico. Casi todas las ectopeptidasas tienen una especificidad amplia, o sea hidrolizan múltiples peptidos, por lo que su contribución precisa a la funcionalidad de circuitos específicos es difícil de obtener. La PPII tiene la peculiaridad de que es una ectopeptidasa con una especificidad muy estrecha. Por lo tanto, nos encontramos en una situación simplificada que nos permitirá relacionar la manipulación de esta enzima con la participación de un solo sistema peptidergico, el TRHergico. Los resultados que obtendremos deberían contribuir a entender mejor en general el papel de las ectopeptidasas en el sistema nervioso central, sin las complicaciones de interpretación que existen en el caso de otras ectopeptidasas. _x000D_ Los antecedentes revisados previamente indican que la TRH esta involucrada de manera critica en el balance energético. Esta función se debe en parte a que las neuronas hipofisiotropicas del NPV que secretan la TRH controlan la secreción de TSH y por lo tanto de HT. Existe además otro papel mucho menos estudiado, que el efecto anoréxico del TRH inyectado centralmente ha revelado. Los circuitos blancos de este efecto anoréxico son desconocidos. _x000D_ Debido a los graves problemas de salud publica asociados a un desbalance del gasto energético (obesidad y enfermedades asociadas) (Popkin 2007, Balthasar 2009, Villa et al, 2004) parece importante obtener mayor conocimiento sobre los circuitos de control, y en particular sobre la comunicación TRHergica. _x000D_ Los datos obtenidos en nuestro y otros laboratorios sugieren que la PPII inactiva al TRH en el medio extracelular y controla la eficacia del TRH. Estas conclusiones son consistentes con el dogma de que el mecanismo principal de inactivación de peptidos en el medio extracelular es por ectopeptidasas. Sin embargo, la evidencia obtenida para la PPII es todavía preliminar y falta resolver muchas interrogantes, en particular sobre el papel exacto de la PPII en distintos contextos in vivo. Por ejemplo, no queda todavía clara la importancia relativa de la actividad hidrolitica de la PPII en los diversos compartimentos del eje neuroendocrino, y en particular cual es su papel especifico para el control del balance energético. _x000D_ Hemos obtenido evidencias que sugieren que la PPII localizada en los tanicitos de la eminencia media pudiera controlar la cantidad de TRH que llega a la adenohipofisis, y por lo tanto la secreción de TSH. La evidencia in vivo se basa en parte en el efecto a corto plazo de la inyección del HcPI sobre la secreción de TSH (Sanchez et al, 2009). Sin embargo, en estos experimentos el HcPI inyectado intraperitonealmente pudiera haber inhibido a la PPII en múltiples compartimientos. Falta confirmar definitivamente que la PPII de los tanicitos es critica para el control del eje in vivo. Si es el caso, se pudiera analizar si una manipulación especifica de la PPII de los tanicitos tiene una utilidad pre-clínica._x000D_ En nuestro laboratorio (Pascual et al, 2004), y en otros (Kelly et al, 2005; Matziari et al, 2008), se han desarrollado inhibidores de la actividad de PPII. La mayoría de estos inhibidores esta a nuestro alcance, pero son poco adecuados para estudiar el balance energético, porque el estudio requiere manipulación del animal a largo plazo. Necesitamos inducir una inhibición sostenida de la PPII durante varios días, y por otro lado quisiéramos que la inhibición sea especifica de los tanicitos. Este segundo punto es también importante porque la PPII se expresa en múltiples núcleos en el hipotálamo (y fuera) (Heuer et al, 1998). No parece que se puede lograr ninguno de estos requisitos con la inyección de los inhibidores. Por otro lado, nuestro laboratorio tiene experiencia con el diseño y utilización de oligonucleótidos antisentido (Cruz et al, 2004) o RNAi (Juárez et al, en preparación) contra la PPII, pero su inyección en el cerebro (en los ventrículos o en un núcleo particular) no permite su aplicación en este caso porque estas moléculas difunden hacia el liquido extracelular cerebral, generando un efecto con baja especificidad regional._x000D_ Consideramos preferible analizar modelos animales en los cuales se haya inactivado el gen de la PPII, si posible de manera controlada, para inactivar la PPII en tipos celulares precisos y en momentos adecuados. Por lo tanto, el propósito principal de esta solicitud es la caracterización de varias líneas de ratones con una inactivación generalizada o especifica del gen de la PPII, y el análisis del aspecto del fenotipo ligado al balance energético. La caracterización de estos ratones permitirá utilizar estos modelos para resolver en el futuro otras preguntas sobre el papel de la PPII._x000D_ De hecho existe una línea de ratón “knockout” de la PPII ya caracterizada de manera preliminar (Tang et al, 2010), así como células ES listas para producir un ratón “knockout” condicional de la PPII (accesibles a través del “International Knockout Mouse Consortium”), por lo que se reducirá al mínimo el esfuerzo a realizar para obtener estas líneas. El hecho de que el ratón “knockout” de la PPII (macho) tenga un peso reducido (Tang et al, 2010) es muy interesante porque confirma la relación entre la enzima y el balance energético. Sin embargo, falta tratar de explicar a que se debe este fenotipo, porque no hay datos funcionales que lo explican. Los antecedentes sobre el papel del TRH sugieren que se pudiera deber a un decremento de la ingesta de alimentos y/o a un incremento del gasto energético basal y/o a un incremento de la actividad motora espontanea. La ausencia de efecto en las hembras es consistente con múltiples datos que muestran que el balance energético es afectado por los estrógenos. Por ejemplo, hemos mostrado que el 17beta estradiol reduce la síntesis de TRH en las neuronas del NPV (Uribe et al, 2009)._x000D_ _x000D_ Acabamos de tener la aprobación de un proyecto del CONACYT (fondo SEP-CONACYT, convocatoria 2010) cuyo objetivo es describir cambios en la expresión de la PPII de los tanicitos durante el ayuno, identificar reguladores de la expresión y manipular su expresión con RNAi. Este objetivo es independiente de los incluidos en esta nueva solicitud a la DGAPA-UNAM, pero los resultados de los dos proyectos serán complementarios._x000D_ _x000D_ Referencias adicionales_x000D_ -- Balthasar N. 2009 Exp Physiol. 2009 ;94:857-66. _x000D_ --*R. Cruz, L. Chávez-Gutiérrez, P. Joseph-Bravo and J.-L. Charli. 3,3',5',-triiodo-L-thyronine reduces efficiency of mRNA knock-down by antisense oligodeoxynucleotides: a study with pyroglutamyl aminopeptidase II in adenohypophysis. Oligonucleotides, 14: 176-190 (2004)._x000D_ --Heuer H, Ehrchen J, Bauer K, Schäfer MK. Eur J Neurosci. 1998 Apr;10(4):1465-78._x000D_ -- Popkin BM. 2007 The world is fat Sci Am. 297:88-95_x000D_ -- Villa AR, Escobedo MH, Mendez–Sanchez N. 2004 Gac Med Mex; 140:S21-25._x000D_ --*R. M. Uribe, M. Zacarías, G. Corkidi, M. Cisneros, J.-L. Charli and P. Joseph-Bravo. 17β-oestradiol inhibits TRH expression in neurones of the hypothalamic paraventricular nucleus of female rats and blunts thyroid axis response to cold stress, Journal of Neuroendocrinology, 21, 439-448 (2009)._x000D_ _x000D_ Referencias de la sección metodos_x000D_ _x000D_ --Kiwaki K, Kotz CM, Wang C, Lanningham-Foster L, Levine JA Am J Physiol Endocrinol Metab. 2004;286:E551-9._x000D_ -Klieverik LP, Coomans CP, Endert E,et al Endocrinology. 2009 ;150:5639-48._x000D_ --*C. Pérez-Monter, M. Martínez-Armenta, A. Miquelajauregui, M. Furlan-Magaril, A. Varela-Echavarría, F. Recillas-Targa, V. May, J.-L. Charli and L. Pérez-Martínez. The Krüppel-like factor 4 controls biosynthesis of thyrotropin-releasing hormone during hypothalamus development. Molecular and Cellular Endocrinology, 333, 127-133 (2011)._x000D_ --Sánchez E, Singru PS, Acharya R, Bodria M, Fekete C, Zavacki AM, Bianco AC, Lechan RM. Endocrinology. 2008 ;149:4329-35._x000D_ --* R. Ubieta, R. M. Uribe, J. A. González, A. García-Vázquez, C. Pérez-Monter, L. Pérez-Martínez, P. Joseph-Bravo and J.-L. Charli. BDNF up-regulates pre-pro-TRH mRNA expression in the fetal/neo