El plegamiento de proteínas es un problema muy complejo y cada vez más relevante por el papel tan importante que las proteínas juegan tanto en procesos biológicos como en su potencial uso como biocatalizadores. Es pues impostergable el estudio de los mecanismos que sigue una proteína para plegarse a su forma funcional de manera que no sólo se genere conocimiento básico sino también información que será relevante para la producción a gran escala y con altos rendimientos de proteínas con un interés industrial o farmacéutico, así como su entendimiento en los procesos biológicos _x000D_ Los intereses de la investigadora se han centrado en el estudio de barriles TIM. Este interés radica en la importancia que este plegamiento tiene dentro de proteínas con función enzimática., ya que se pueden encontrar catalizando cinco de los seis diferentes tipos de reacción (de acuerdo a la clasificación de enzimas, E.C.) (1, 2), lo que lo hace un andamiaje muy atractivo para el desarrollo de biocatalizadores de novo. _x000D_ Los barriles TIM se encuentran formados por ocho repeticiones de subunidades (βα) unidas a través de asas. Las asas que unen las hélices α a las hebras β (se consideran la parte inferior del barril) son generalmente cortas y parecen ser relevantes para la estabilidad del barril (3); mientras que las asas que unen las hebras β a las hélices (parte superior del barril) son de tamaño variable y conforman el sitio activo de la enzima. Las hebras beta se encuentran formando el centro del barril y están rodeadas hacia el exterior por las hélices α, de manera que el extremo amino se encuentra cercano al extremo carboxilo. La simetría de este plegamiento invita a pensar en un origen común a partir de la duplicación génica de fragmentos más pequeños. De hecho el análisis de secuencias de los genes his A y his F en la ruta biosintética de histidina sugiere la duplicación de la mitad del gene (4, 5), la formación de una proteína estable a partir de las mitades de estas dos enzimas refuerza esta hipótesis (6). _x000D_ No obstante, la posibilidad de estar formado por subunidades de plegamiento independientes, las interacciones que dirigen el plegamiento han sido optimizadas a lo largo de la evolución en cada caso; de manera que en la secuencia no sólo se encuentra codificado el plegamiento final de la proteína, sino el orden en que ésta se debe plegar para evitar la formación de intermediarios de vías de plegamiento improductivas. Y éste ha sido también un criterio para identificar un origen divergente (7)._x000D_ En nuestro laboratorio se utiliza el plegamiento de barriles TIM como templado para evolucionar funciones. La generación de variantes para tales fines puede realizarse mediante mutagénesis azarosa del gene y barajeo de mutantes obtenidas. Sin embargo, en la mayoría de proyectos llegamos a la conclusión de que la variabilidad introducida es muy limitada como para explorar un cambio de función significativo. La generación de variantes puede verse favorecida al recombinar fragmentos de diversas enzimas con este plegamiento, ya que se estarían provocando cambios mucho más drásticos que los cambios puntuales que se pueden lograr con la mutagénesis al azar. Sin embargo, el considerar exclusivamente el sitio activo para hacer estos cambios conlleva el riesgo de ignorar que las proteínas han evolucionado no sólo para optimizar una función dada, sino su estabilidad tanto termodinámica como cinética. _x000D_ La elucidación de los mecanismos de plegamiento resulta entonces fundamental para un mejor entendimiento de las fuerzas que dirigen el plegamiento de estas proteínas. En el presente proyecto se pretende entender el papel que juega la topología en el plegamiento de estructuras de tipo barril TIM, para lo cual contamos con dos modelos, la triosa fosfato isomerasa de Trypanosoma brucei y la fosforibosil antranilato isomerasa (PRAI) de E. coli. En el presente proyecto se pretende generar azarosamente diversas permutaciones circulares de las proteínas en cuestión. La selección de variantes bien plegadas se puede llevar a cabo mediante un reportero fusionado al gene de la enzima, como puede ser la acetil cloramfenicol transferasa, que estaría proveyendo con resistencia a cloramfenicol si se encuentra precedida de una enzima bien plegada. Adicionalmente, se puede detectar la actividad de las variantes mediante complementación in vivo de la función en las cepas de E. coli con el respectivo gene deletado (8, 9). El análisis de secuencia de aquellas variantes que den lugar a plegamientos estables permitirán identificar los módulos de plegamiento independientes, que podrían ser utilizados como casetes para formar proteínas quiméricas en las que se puedan investigar actividades novedosas o propiedades diversas._x000D_

En el presente proyecto pretendemos identificar las unidades mínimas de plegamiento de dos proteínas con estructura de barril TIM que han sido utilizadas en nuestro laboratorio como templado para llevar a cabo evolución dirigida en busca de desarrollar actividades de novo. La generación de permutaciones circulares que den lugar a un plegamiento estable permitirá delimitar los módulos de plegamiento independientes. Aunque nosotros ya hemos podido identificar que fragmentos de cuatro subunidades β/α en PRAI son capaces de plegarse y ensamblarse in vivo para restablecer la función, intentos de construir los fragmentos 6 + 2 fueron infructuosos en la complementación de la función, a pesar de las evidencias que existen de que durante el plegamiento de estas proteínas se forma un intermediario en el que las seis primeras subunidades β/α se encuentran plegadas. Nosotros atribuimos la falta de complementación a la estabilidad marginal del fragmento formado por las dos últimas subunidades β/α. En este sentido, el uso de permutaciones circulares permitirá la identificación de subestructuras que de no encontrarse en el contexto del resto de la proteína no tendrían suficiente estabilidad para ser observadas. A diferencia de otros trabajos realizados sobre el tema, nuestra exploración pretende abarcar todos los posibles sitios en que se puede permutar la proteína, incluyendo regiones de estructura secundaria que no han sido explorados. La caracterización cinética del plegamiento de las variantes permutadas permitirá evaluar el efecto de la topología en la formación y estabilización de enzimas que tienen un plegamiento de barril TIM. Las similitudes o discrepancias entre miembros de este tipo de plegamiento contribuirán a descifrar el origen evolutivo de estas enzimas. _x000D_ Finalmente, la identificación de módulos independientes de plegamiento nos permitirá formar quimeras que sean un punto de origen para generación de librerías que pueden aportar propiedades novedosas ya sea de actividad o de unión a compuestos diversos._x000D_