En nuestro grupo de investigación estamos enfocados en el estudio básico y aplicado del metabolismo central de carbono (MCC) y del metabolismo aromático (MA) en la bacteria Escherichia coli. En este contexto, aplicamos diferentes aproximaciones de la ingeniería de vías metabólicas (IVM) en esta bacteria con la finalidad de obtener mutantes sobreproductoras de metabolitos aromáticos de interés industrial, las cuales han sido evaluadas en su capacidad de producción de los compuestos de interés en cultivos a nivel matraz y en fermentadores tipo lote._x000D_ _x000D_ Tomando como fondo genético de partida a la cepa de E. coli JM101 y con la finalidad de incrementar la disponibilidad del precursor del MCC, fosfoenol piruvato (PEP), hacía la síntesis de compuestos aromáticos, se inactivó el sistema de fosfotransferasa de glucosa dependiente de PEP (PTS:Glc:PEP), obteniendo así una mutante PTS- (designada como PB11), la cual presenta una muy limitada capacidad de crecimiento en glucosa. El cultivo de esta cepa en quimiostato con diferentes tasas de alimentación de glucosa, permitió la selección de mutantes con una mayor capacidad de asimilación de éste azúcar como fuente de carbono, dentro de las que destaca la cepa denominada como PB12 (Flores et al., 1996; 2007), la cual ha sido caracterizada a nivel transcriptómico y por análisis de flujo de carbono (Flores et al., 2002; 2005; Flores et al., 1996; 2004; 2005; 2007; 2008; Olvera et al., 2009) y recientemente a nivel genómico. _x000D_ _x000D_ La clonación en un plásmido de una copia de los genes tktA y aroGfbr, que codifican respectivamente, para la enzima transcetolasa I y para la DAHP sintasa AroG resistente a inhibición por acumulación de fenilanalina (AroGfbr) (Balderas et al., 2009), y su transformación en la cepa PB12, permitió en esta cepa una mayor disponibilidad de eritrosa-4-P (E4P) y un incremento (junto con el PEP), en el flujo hacia la vía de síntesis de compuestos aromáticos. Este fondo genético (PB12, PTS- aroGfbr tktA), ha sido utilizado por mi grupo de trabajo para la producción de fenilalanina (Báez-Viveros et al., 2007), para la producción de DAHP (primer intermediario de la vía de síntesis de compuestos aromáticos) (Martínez et al., 2008) y recientemente, este fondo genético en combinación con la inactivación de los genes aroK y aroL que codifican para las enzimas shikimato cinasas I y II, respectivamente, y con la clonación de una copia de los genes aroB y aroE, que codifican respectivamente para las enzimas DHQ sintasa y shikimato deshidrogenasa, para la síntesis de shikimato, intermediario de la vía de aromáticos utilizado como precursor para la síntesis química de compuestos antivirales contra influenza estacional, aviar (H5N1) y también contra virus de influenza humana (A/H1N1) (Escalante et al., 2010)._x000D_ _x000D_ La caracterización fisiológica de la cepa PB12 mostró que desarrolló la capacidad de consumir de forma simultánea dos fuentes de carbono: glucosa+gluconato , glucosa+arabinosa y glucosa+glicerol (Flores et al., 2007; Martínez et al., 2008) y glucosa+acetato (Flores et al., 2005; Sigala et al., 2009). Este último resultado, demuestra la capacidad gluconeogénica de esta cepa y su potencial para incrementar la disponibilidad de PEP para la síntesis de compuestos aromáticos._x000D_ _x000D_ Con base en estos antecedentes, se propone como objetivo general de esta propuesta la modificación del MCC glicolítico y gluconeogénico, junto con la vía de síntesis de compuestos aromáticos por IVM en cepas derivadas de la PB12, con la finalidad de_x000D_ (1) Incrementar la capacidad de asimilación de glucosa._x000D_ (2) Modulación de la expresión de genes clave en la vía de síntesis de shikimato en la cepa PB12 aroK-aroL-: aroGfbr y tktA, aroB y aroE._x000D_ (3) Evaluación del fondo genético PB11, PB12 y PB12 aroK-aroL- para separar los metabolismos glicolítico y gluconeogénico mediante la inactivación de los genes pykF, pykA y ppsA, que codifican respectivamente para las enzimas piruvato cinasa I y II y PEP sintetasa, en estas cepas con la finalidad de incrementar la disponibilidad de PEP._x000D_ (4) Evaluación del efecto de las modificaciones genéticas realizadas sobre la producción de compuestos aromáticos (shikimato), en sistemas de fermentación en lote y en lote alimentado utilizando glucosa y glucosa+acetato._x000D_ (5) Caracterización de las cepas mutantes derivadas a nivel transcriptómico por qPCR y a nivel metabólico: actividades enzimáticas involucradas y determinación de intermediarios del metabolismo CCC y vía de aromáticos. _x000D_

La presente propuesta se enmarca en una línea de investigación que tiene como finalidad:_x000D_ _x000D_ (i) Aportar información básica a nivel genómico, transcriptómico y metabólico de cepas de E. coli PTS- sobre los efectos de esta mutación sobre el transporte de fuentes de carbono, metabolismo central de carbono y metabolismo gluconeogénico. Esta línea de investigación ha permitido la publicación de 9 artículos en revistas internacionales indizadas desde el 2002 y la formación de diversos recursos humanos a nivel de posgrado y licenciatura._x000D_ _x000D_ (2) El uso de las cepas PTS-, particularmente la cepa denominada PB12, ha sido utilizada con éxito por nuestro grupo de trabajo y por diversos colaboradores para la producción de diferentes metabolitos aromáticos de interés industrial, entre los que destaca recientemente el shikimato (shk), intermediario de la vía común de síntesis de compuestos aromáticos, que es utilizado para la síntesis de compuestos antivirales contra influenza estacional, aviar H5N1 y recientemente contra el virus de influenza humana A/H1N1. En este contexto, recientemente hemos publicado la obtención de una cepa derivada de E. coli PB12 (PB12.SA22: PTS-. aroK- aroL-, aroGfbr, tktA, aroB aroE) sobreproductora de shk, la cual presenta el mayor rendimiento (mol shk/mol de glucosa) reportado hasta la fecha (Escalante et al., 2010), por lo que los objetivos planteados en esta propuesta, tienen como finalidad aplicar diferentes estrategias de ingeniería de vías metabólicas en las cepas PTS- de E. coli obtenidas en nuestro laboratorio y en la cepa PB12.SA22 para incrementar aún más la producción y rendimiento de este compuesto en sistemas de fermentación en lote y por primera vez en lote alimentado. _x000D_ _x000D_ De forma complementaria a la obtención de cepas derivadas sobreproductoras de shk, se realizará la caracterización transcriptómica, fisiológica y bioquímica en sistemas de producción de las cepas resultantes de interés. Es importante destacar, que a la fecha, no existen reportes sobre este tipo de estudios en la literatura en condiciones de producción utilizando medios complejos._x000D_ _x000D_ En conclusión, los resultados derivados de este proyecto tendrán una importante aportación en el campo de la genética y fisiología de E. coli y por otro lado, la aplicación industrial de estas cepas para la producción de shk, es muy valiosa, puesto que permitirán la posibilidad de contar con una tecnología propia para la obtención de este compuesto que es y será de gran importancia, en el contexto de la síntesis de compuestos antivirales contra influenza._x000D_ _x000D_ En cuanto a la formación de recursos humanos, en el presente trabajo participarán 4 alumnos de posgrado ya inscritos (dos de maestría y dos de doctorado en Ciencias Bioquímicas, UNAM), los cuales prácticamente estarán concluyendo su proyecto de investigación al término del segundo año de la propuesta que se somete. Se espera también, la publicación de al menos dos artículos en revistas internacionales indizadas como resultado de estos dos proyectos de doctorado.