Los sistemas biológicos pueden ser descritos como sistemas químicos acoplados de altísima complejidad, cuyo comportamiento incluye dos características esenciales: la auto-reproducción y el metabolismo. Invariablemente, en cada uno de los procesos químicos que sustentan a estas propiedades se encuentra el desempeño altamente especializado de las proteínas. La cinética enzimática, la replicación y traducción de genes, el transporte de moléculas pequeñas, la diferenciación entre lo propio y lo no propio, la comunicación sináptica, los sistemas de homeostasis corporal y la percepción sensorial son tan sólo algunos ejemplos cuyo andamiaje procesal se sustenta en el reconocimiento no covalente por parte de las proteínas. Así, en la visión molecular actual sobre la vida, las proteínas toman su lugar como sofisticadas y versátiles obreras que se encargan de operar la fabulosa maquinaria química que constituye la fábrica celular. Por tanto, la comprensión de la forma en que las proteínas funcionan es, ha sido y seguirá siendo un aspecto sustantivo en la comprensión de las bases moleculares de la vida._x000D_ _x000D_ Nuestro grupo de investigación ha estado enfocado en profundizar nuestra comprensión sobre las bases energético-estructurales del funcionamiento de las proteínas. La solución del problema de los determinantes de la estabilidad precisa de establecer vínculos cuantitativos entre la energética y la estructura de los sistemas en estudio. Por tanto, nuestros estudios contemplan la caracterización calorimétrica de la formación de diferentes sistemas proteicos con estructura 3D conocida. Por otro lado, hacemos uso de técnicas espectroscópicas de diferente resolución (dicroísmo circular, fluorescencia, dispersión dinámica de luz, difracción de rayos X, RMN) para complementar la información estereoquímica. Esta información bipartita ha sido usada para desarrollar y calibrar modelos que permiten predecir la estabilidad a partir del análisis de su estructura tridimensional. Usando como plataforma este marco cuantitativo, recientemente hemos iniciado una vertiente enmarcada en la ingeniería de proteínas, en la cual se persigue la modificación racional de la especificidad de proteínas._x000D_ _x000D_ El presente proyecto representa una continuación al proyecto PAPIIT IN204609 “Bases energético-estructurales del reconocimiento proteico”. Además del responsable, estarán involucrados en su desarrollo 4 investigadores y una técnica académica, que darán mayor vigor a aspectos de la investigación en los cuales ellos son probadamente competentes. Participarán también 5 alumnos de doctorado y 3 de licenciatura, todos ellos estudiantes en activo, así como de 2 alumnos por ingresar al Posgrado. Esta favorable situación nos permite plantear nuevos y más ambiciosos objetivos, que sin duda ayudarán a fortalecer y potenciar la investigación propuesta._x000D_ El apoyo aquí solicitado nace de los requerimientos necesarios para dar viabilidad financiera a nuestra línea de investigación durante los tres años próximos venideros. En particular, se requiere apoyo para el costoso proceso de producción proteínas recombinantes mediante técnicas de biología molecular y su correspondiente purificación a homogeneidad. Esto impactará favorablemente en una mayor disponibilidad de sistemas proteicos a estudiar, y en la posibilidad de generar mutantes tanto para responder aspectos puntuales del comportamiento energético-estructural observado como para la producción de proteínas con actividad modificada._x000D_

El presente proyecto está concebido para contribuir en tres planos diferentes dentro del campo de las bases moleculares del funcionamiento de proteínas. (1) Se pretende ahondar en nuestro conocimiento sobre los principios moleculares que gobiernan la formación de complejos de proteína. De igual forma, se espera ganar nueva luz sobre el plegamiento y organización estructural de una lectina que goza de un amplio interés en el cambio de la Glicobiología. (2) Teniendo este marco cuantitativo como referencia, proponemos la modificación racional de la especificidad en el reconocimiento de ciertos modelos proteicos. (3) En otro plano, se plantea que este proyecto contribuya a consolidar y fortalecer la calorimetría de proteínas en nuestro país. A continuación se detalla las principales contribuciones por sistema de estudio planteados en este proyecto._x000D_ _x000D_ 1) RECONOCIMIENTO MOLECULAR_x000D_ _x000D_ 1.1 Complejos Proteína-Carbohidrato_x000D_ _x000D_ AGT. La AGT forma homodímeros transitorios débiles (21). Haciendo una revisión de los parámetros de unión de la AGT por sus ligandos reportados en la literatura, caímos en la cuenta que se utilizaron concentraciones de proteína con las que, de acuerdo a nuestros datos calorimétricos, al menos 50% de protómeros están en forma libre. Como los sitios de unión se encuentran en la interfase dimérica, el ligando conlleva una redistribución de poblaciones del equilibrio monómero-dímero. Se sigue de ello que todos los parámetros reportados hasta el momento son tan sólo aparentes._x000D_ Pretendemos disecar de manera fina los parámetros intrínsecos de unión de la AGT a oligómeros de la GlcNAc. La estrategia partirá de la expresión por separado cada uno de los cuatro dominios de esta lectina (A,B,C,D), así como las diferentes combinaciones bi (AB,BC,CD) y tri-dominio (ABC, CD). Hemos expresado y purificado los dominios A y D, y contamos con las subclonas de las otras construcciones de AGT, gracias al apoyo de la Dra. Patricia Cano, técnica responsable del laboratorio de Biología Molecular del IQ. Se estudiará por ITC la unión a ligandos de las diferentes construcciones, lo cual nos permitirá establecer los parámetros de unión de cada dominio, así como la posible ocurrencia de efectos de cooperatividad inter-dominio. Para resolver los parámetros de unión a la lectina completa, se realizarán titulaciones con la AGT intacta, con concentraciones variables de proteína. Las curvas de unión serán analizadas con un modelo que considere de manera explícita el equilibrio de dimerización y la unión del azúcar a cada uno de los dominios aislados (incluyendo los posibles efectos cooperativos entre éstos) en el monómero libre y dimerizado._x000D_ _x000D_ Dado que las diferentes construcciones de AGT podrán ser enriquecidas isotópicamente, se determinarán las estructuras 3D correspondientes en presencia y ausencia de ligando mediante RMN. El monómero de la AGT posee 171 residuos, lo cual lo hace un sistema adecuado para el equipo de RMN de 500 MHz con el que se cuenta. Para este objetivo, se contará con la participación del Dr. José Federico del Río, investigador del IQ, quien fue el primero en resolver la estructura de una proteína mediante RMN en México (29)._x000D_ _x000D_ RB. Intentos previos en nuestro laboratorio de obtener expresada correctamente RB en E. coli han sido infructuosos. Con el fin de superar este obstáculo, estamos colaborando con los Drs. Maurico Trujillo y Norma Adriana Valdez del IIB de la UNAM, expertos tanto en la expresión como correcto replegamiento de proteínas recombinantes complejas (24). RB es una glicoproteína. El papel que juegan los glicanos en el funcionamiento y estabilidad de RB son desconocidos. Para evaluar este aspecto, se expresarán RB glicosilada y desglicosilada en P. pastoris y E. coli, respectivamente. Se estudiará la interacción de estas dos formas de RB con galactosa y algunos de sus derivados mediante ITC. _x000D_ _x000D_ CAMBIO DE ESPECIFICIDAD DE LISOZIMA. Actualmente contamos con diferentes mutantes de lisozima diseñadas para modificar la especificidad de esta enzima glicohidrolítica de quitinasa a celulasa. Para dicha modificación, es necesario realizar las siguientes mutaciones:_x000D_ _x000D_ I98Q,I58Q,L56S,W108Y,A31M,A95I,L75R,A107N,W63Y_x000D_ _x000D_ Serán expresadas mutantes parciales, que nos permitan ir disecando el efecto acumulado sobre el cambio en la especificidad. Contando con el apoyo de los Drs. Maurico Trujillo y Norma Adriana Valdez, se espera resolver la expresión en el corto plazo. Se procederá al análisis calorimétrico y espectroscópico (dicroísmo circular y fluorescencia) de las mutantes, para evaluar su habilidad para reconocer oligómeros β14 de la Glc. A partir de estos datos, se evaluará la conveniencia de efectuar un segundo ciclo de diseño computacional, con el fin de mejorar la afinidad y/o especificad hacia fragmentos de celulosa._x000D_ _x000D_ 1.2. Complejos Proteína-Proteína_x000D_ _x000D_ βLG. En esta nueva etapa del proyecto, exploraremos la posible intercomunicación entre los procesos de auto-asociación y el reconocimiento a ligandos. Para cuantificar estos efectos, se realizarán experimentos de ITC para el complejo βlg-SDS en función de la concentración de proteína. Los parámetros intrínsecos y de cooperatividad de unión serán resueltos haciendo uso de la teoría de polinomiales de unión, la cual parte de resolver experimentalmente la función de partición del sistema (30). Se realizarán estudios por dinámica molecular del dímero de la βlg tanto en ausencia como en presencia de SDS (28) para evaluar los rearreglos en la interfase dimérica y en la dinámica estructural del dímero debido a la presencia del ligando._x000D_ _x000D_ AGT. Se caracterizarán las propiedades de dimerización de las isoformas 2 y 3 de la AGT mediante IDC, de manera semejante a como se realizó con la isoforma 1 (21). Por otro lado, se realizarán mediciones usando soluciones amortiguadoras de entalpía de ionización variable, con el fin de evaluar como función del pH el número de protones intercambiados durante el proceso de dimerización (2)._x000D_ _x000D_ 1.3 Complejos Proteína-Nucleótido_x000D_ _x000D_ ATP SINTASA. La determinación de las propiedades energéticas asociadas a la unión de ligandos en las subunidades catalíticas y no catalíticas dentro del complejo F1 permitirá conocer más a fondo la relación entre sitios y sustratos en el mecanismo catalítico de hidrólisis-síntesis de ATP y posiblemente generar un modelo de acoplamiento estructural entre subunidades, que permita entender de forma más completa los cambios conformacionales entre subunidades. Se realizará la caracterización calorimétrica de la unión de nucleótidos por parte de la subunidad  aislada, de manera análoga a como se realizó Tβ aislada (17). Además, se estudiará la asociación de nucleótidos a F1. Debido a la complejidad de F1, se plantea generar dos tipos de mutantes. Una en la cual los residuos de unión de las subunidades α sean eliminados, y otra equivalente para β. A través de la caracterización de las tres construcciones de F1, será posible determinar con precisión los parámetros de unión de los 6 sitios de unión. Los parámetros intrínsecos y de cooperatividad de unión serán resueltos haciendo uso de la teoría de polinomiales de unión (30)._x000D_ _x000D_ GTPASA EFL1. Se usará ITC para medir la interacción de Efl1 con MgGDP y con GTPγS, un análogo no hidrolizable del sustrato (17). Esta información se correlacionará con resultados de titulaciones espectroscópicas (dicroísmo circular, fluorescencia). Además, se realizarán mediciones de unión a nucleótidos de guanina en presencia y ausencia de magnesio, con el fin de evaluar el efecto estabilizante de este ión metálico en la interacción. Se cuantificará calorimétricamente la interacción entre Efl1 y Sdo1, y el efecto de esta interacción en la capacidad de Efl1 para reconocer nucleótidos. Finalmente, se generarán mutantes de Efl1 que tengan alterada la unión a Mg y/o nucleótidos de guanina, para evaluar su funcionalidad en estudios de complementación genética en células Efl1Δ. Lo anterior representa un eslabón de gran importancia para entender la contribución molecular de esta proteína en la biogénesis ribosomal. Para la realización de estas pruebas, se contará con el apoyo de la Dra. Nuria Sánchez, del