Síntesis del proyecto propuesto._x000D_ _x000D_ El proyecto propuesto se relaciona con el uso de péptidos activadores de LCAT como una enzima plasmática involucrada en la adecuada generación de partículas tipo HDL-C y cuyos bajos niveles en plasma están directamente relacionados con el desarrollo de la aterosclerosis. _x000D_ _x000D_ Descripción del proyecto. _x000D_ _x000D_ Desde hace tiempo la literatura ha reportado evidencia de que los niveles de la lipoproteína de alta densidad (HDL) son inversamente proporcionales al riesgo de desarrollar aterosclerosis. La HDL es un complejo proteína-lípido, siendo su principal componente proteico la apolipoproteína A1 (apo A1). La apo A1 funciona como el ligando para el receptor de HDL en el hígado y como activador de enzimas que regulan el contenido lipídico y remodelación de dicha lipoproteína. Una de las enzimas que activa apo A1 es la lecitina colesterol acil transferasa (LCAT). LCAT es una glicoproteína que cataliza la formación de casi todo el éster de colesterol plasmático en humanos mediante la transferencia de un grupo acilo graso de la posición sn-2 de la fosfatidilcolina (lecitina) al grupo 3--hidroxilo del colesterol, dando como productos lisofosfatidilcolina (lisolecitina) y un éster de colesterol que es transferido al núcleo de la HDL._x000D_ Existen diversas subclases de HDL, siendo la más importante la subclase HDL-C. Esta partícula está relacionada con el proceso del transporte reverso de colesterol (TRC), en el cual se transporta el exceso de colesterol de tejidos periféricos hacia el hígado para su excreción como sales biliares y por tanto presenta una protección antiaterogénica (Gordon DJ, Rifkind BM. High-density lipoproteins: the clinical implications of recent studies. N Engl J Med. 1989; 321: 1311-1316)._x000D_ _x000D_ Por otro lado, se ha observado que a pesar de tener los niveles correctos de colesterol relacionado con HDL, podría no tenerse la composición correcta de proteína-lípido en estas partículas y por tanto no realizar adecuadamente la función de TRC. Este tipo de anormalidades se observan en pacientes con mutaciones de apo A1 por ejemplo Apo A1(Zavalla) (L159P) y en consecuencia presentan una disminución importante de la población HDL-C, no obstante la actividad de su enzima LCAT tiene una función normal (Miller M, Aiello D, Pritchard H, Friel G, Zeller K. Apolipoprotein A-IZavalla (Leu159Pro) HDL Cholesterol Deficiency in a Kindred Associeated With Premature Coronary Artery Disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 1998; 18(8):1242-1247. Esto ha resaltado la importancia de ciertas regiones de la apo A1 sobre la actividad de LCAT y su subsecuente generación de HDL-C. De esta forma, se ha propuesto el uso de péptidos derivados de apo A1 como potenciadores de la activad de LCAT en casos donde se presenten las deficiencias antes citadas. _x000D_ _x000D_ Nuestros péptidos han sido sintetizados con base en la secuencia reportada de apo A1 y seleccionados en función de sus propiedades fisicoquímicas como: carga, momento hidrofóbico, capacidad de formar hélices alfa y una putativa función en la apo A1 asociada a la HDL. Los péptidos fueron nombrados de acuerdo a las primeras letras de sus aminoácidos: el péptido DRV, correspondiente a la región amino terminal de la apo A1 (residuos 9-24), el péptido KLL a una región intermedia (residuos 45-63) y finalmente el péptido VLES procedente de la región carboxilo terminal (221-239). _x000D_ _x000D_ Una vez seleccionados los péptidos, de manera preeliminar se ha probado su efecto sobre la actividad de LCAT en plasma humano de sujetos sanos. En el método empleado para determinar la actividad de LCAT, se utilizó como sustrato plasma inactivado con colesterol marcado, sistema cuyas condiciones se aproximan a las presentes in vivo. Con este método se determinó tanto la actividad de LCAT en plasma sin péptidos (control de la reacción) como de plasma en presencia de éstos. Para este ensayo los péptidos fueron disueltos en buffer PBS pH 7.4 y preincubados media hora con el plasma antes de iniciar la reacción que se llevó a cabo a 37 oC con determinaciones a 0, 1, 2.5 y 5 h. El efecto de los péptidos se evaluó calculando la velocidad inicial de la reacción de LCAT en plasma y en presencia de péptidos (1- 2.5 h. En estos ensayos se evaluó también el efecto de la apo A1 completa como control positivo, dado que es el activador por excelencia de LCAT. De forma preeliminars e puede concluír de estos experimentos utilizando plasma humano completo que los péptidos favorecieron un aumento en la velocidad inicial de la reacción (Vo) en comparación con el control sin alterar la producción máxima de ésteres de colesterol. Aunque todos los péptidos incrementaron Vo, DRV fue el péptido que presentó un valor más alto; estas diferencias podrían atribuirse a las propiedades fisicoquímicas de cada uno de ellos. En cuanto al tipo de activación es importante notar que, a diferencia del control que presenta una curva de tipo hiperbólico, tanto los péptidos como la apo A1 muestran curvas de tipo sigmoidal que sugieren una activación de tipo alostérica. Dado que las diferencias efectoras de los péptidos dependen de su secuencia y muy probablemente de la conformación, se les realizó un ensayo de dicroismo circular para determinar la estructura secundaria que presentan en solución acuosa, que es el medio en el cual se introdujeron al sistema de ensayo. Los resultados muestran que los péptidos en medio acuoso, se encuentran sin una estructura secundaria definida._x000D_ _x000D_ Ya evaluado el efecto de los péptidos sobre LCAT en plasma, el siguiente paso será el obtener fracciones enriquecidas de la enzima para realizar ensayos con LCAT a concentraciones de enzima óptimas y libres de posibles interferencias debidas a los componentes de plasma._x000D_ _x000D_ Evidencia reciente del laboratorio utilizando péptidos de características similares muestra que los requerimientos para la activación de LCAT por apolipoproteínas y péptidos son la dependencia a la presencia de lípidos específicos y muy probablemente a la presencia de estructuras tipo hélice a con una cara no polar de menos de 180º, una región central de residuos ácidos opuesta a la cara no polar y posiblemente una distribución de residuos básicos en la interface polar-no polar. Así, considerando la importancia de la estructura secundaria de dichos segmentos sobre la acción que éstos ejercen, proponemos controlar la estructura secundaria de los péptidos hacia una conformación estable y definida con propiedades anfipáticas del tipo hélice-a, para de esta manera ser probados en preparaciones enriquedicas o purificadas de LCAT._x000D_ _x000D_ Sin embargo, también se realizarán otra serie de experimentos para evaluar la actividad de estos mismos péptidos en una conformación del tipo beta, así como la utilización de péptidos no relacionados con la secuencia de apo A1 y que presenten las mismas propiedades fisicoquímicas. Una vez definidas estas condiciones podremos proponer un posible mecanismo de acción de estos péptidos sobre la actividad de LCAT, adecuados para promover la formación de HDL-C y por lo tanto interesantes para ser utilizados a mediano plazo como componentes de posibles terapias en el tratamiento y prevención de enfermedades cardiovasculares._x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_

Con fundamento en los resultados preeliminares obtenidos dentro el estudio de los péptidos derivados de la apolipoproteína A-I y su acción sobre la enzima LCAT (Lecitina Colesterol Aciltransferasa) en plasma humano, por primera vez podemos proponer que nuestra hipótesis pareciera ser correcta. La purificación de LCAT y el plan propuesto dentro del presente proyecto para estudiar a los péptidos derivados de Apo A-I y Apo C-I en diferentes medios, nos permitirá definír la importancia clave del tipo de conformación secundaria que deben presentar estos péptidos para llevar a cabo adecuadamente la modulación de la velocidad de racción de la enzima LCAT. De esta forma, conceptos como el de "interruptor molecular" empezarán a tener impacto en el entendimiento de procesos bioquímicos relacionados con diversos cambios conformacionales de proteínas, los cuales al fallar podrían explicar su participación en el inicio de alguna patología como lo es la aterosclerosis.