Las Rho GTPasas son proteínas monoméricas que participan en el control de procesos celulares como la proliferación, la apoptosis, la migración celular, la polaridad celular, el tráfico de la membrana, la regulación de la dinámica del citoesqueleto y la regulación de la transcripción genética. Recientemente identificamos 34 miembros de la familia de Rho GTPasas del pez cebra (Salas-Vidal et al., 2005 y resultados sin publicar). Actualmente estamos enfocados en la caracterización de las funciones que llevan a cabo Rac1 y Cdc42 en el desarrollo embrionario temprano del pez cebra. Del proyecto previo financiado por DGAPA, obtuvimos avances importantes, los cuales se describen a continuación. El pez cebra Danio rerio, a diferencia de otros vertebrados que presentan copias únicas de cada gen, tiene dos copias del gen de rac1 y tres copias del gen de cdc42, denominadas rac1, rac1l, cdc42, cdc42l y cdc42l2. Diferentes análisis bioinformáticos mostraron que las copias de estos genes en pez cebra presentan una estructura genómica conservada con respecto a los genes de humano. Análisis filogenéticos indican que los genes de rac1 y cdc42 son los más conservados con respecto a los genes de humano, y rac1l, cdc42l y cdc42l2 son más divergentes. Por medio de reacciones de RT-PCR, hibridación in situ e inmunohistoquímica encontramos que estos genes y sus productos se expresan de manera ubicua a lo largo del desarrollo de pez cebra. Al provocar la pérdida de función de Rac1 y Cdc42l con oligonucleótidos antisentido, tipo morfolinos, encontramos efectos tempranos en el desarrollo en diferentes procesos que involucran a la migración celular. Encontramos efectos en la epibolia y la gastrulación (cdc42l) y en la convergencia y extensión (rac1). Logramos confirmar que se afecta al citoesqueleto de actina por medio de histoquímica. Del citoesqueleto de tubulina no pudimos confirmar los efectos por inmunolocalización pero encontramos un incremento muy notable en la cantidad de proteína por medio de western blot (rac1 y cdc42), lo cual sugiere fuertemente que esto podría afectar el comportamiento celular por medio de cambios en la dinámica del citoesqueleto. El análisis del transcriptoma y proteoma mostraron que la pérdida de función de estas Rho GTPasas afecta la expresión de componentes del citoesqueleto como actina y tubulina así como de moléculas reguladoras de la dinámica del citoesqueleto y de la migración celular como rock2, cap1, gelsolin, b-catenina, la anexina V y selenoproteínas como gpx4. Además fue interesante encontrar que también se afectó la expresión de diferentes Rho GTPasas lo cual sugiere que hay redes de interacción entre diferentes Rho GTPasas. _x000D_ En el presente proyecto queremos ahondar en el análisis de los efectos provocados por la pérdida de función de Rac1 y Cdc42 sobre la dinámica de la migración celular y las redes de regulación genética en las que participan durante el desarrollo embrionario temprano del pez cebra.

El presente proyecto es una continuación del primer proyecto apoyado por DGAPA. A continuación se describen solo algunos de los principales hallazgos hechos en los últimos tres años y de manera específica en que planeamos contribuir en el presente proyecto. _x000D_ _x000D_ CDC42 EN EL CONTROL DE LA INTERCALACIÓN Y EL INICIO DE LA EPIBOLIA._x000D_ El pez cebra Danio rerio, a diferencia de otros vertebrados, presenta tres copias del gen de Cdc42 denominadas cdc42, cdc42l y cdc42l2, que presentan una estructura genómica conservada con respecto al gen de humano. A nivel de la secuencia del ADN y de la proteína, cdc42 es la más conservada con respecto al gen de humano, y cdc42l2 la más divergente. Por medio de RT-PCR e hibridación in situ encontramos que estos genes se expresan de manera ubicua en los embriones de pez cebra lo cual sugiere que juegan diferentes funciones a lo largo del desarrollo. A pesar de que cdc42l es más divergente que cdc42, con respecto al gen de humano, encontramos que la pérdida de función de cdc42l por la inyección de un morfolino específico, afectó la migración celular del blastodermo por la intercalación que inicia a la epibolia, siendo esto más evidente en las células de la capa profunda; no así el morfolino contra cdc42, que no presentó ningún efecto notable en el desarrollo temprano. Como se menciona en los antecedentes en el desarrollo normal, así como en los embriones control, la intercalación provoca que se adelgace el blastodermo iniciando el recubrimiento de la célula del vitelo por epibolia, lo cual parece estar afectado en los embriones con pérdida de función de cdc42l. Estos resultados muestran hallazgos importantes que no han sido descritos previamente por otros grupos de investigación y que serán una contribución importante. En primer lugar, estos resultados indican que las copias del gen cdc42 no son redundantes funcionalmente. En segundo lugar indican que cdc42l, a pesar de ser más divergente, parece ser el homólogo funcional de Cdc42 de otros vertebrados como el humano y el ratón. En el presente proyecto queremos ahora caracterizar a detalle como se afecta la intercalación de las células del blastodermo por medio de técnicas de microscopía de alta resolución y de visualización en 4D (en el tiempo y en el espacio), para analizar a qué nivel están siendo afectadas las células del blastodermo como la generación de proyecciones celulares como filopodios y lamelipodios importantes para la migración, o bien si se está afectando la dirección y/o la velocidad de la intercalación. Como se menciona en los antecedentes otros grupos han propuesto que posiblemente la activación de Rac1 se encuentra debajo de Cdc42 en desarrollo embrionario temprano en vertebrados. Queremos ahora verificar si al provocar la pérdida de función de Cdc42l baja también la expresión de Rac1, verificado por PCR cuantitativo y western blot, o bien si se afecta la activación de Rac1, verificándolo por medio de la detección de la forma activa de Rac1 unido a GTP la cual se sabe que provoca su activación. Recientemente se reportaron unos anticuerpos que son capaces de reconocer la forma activa de Rac1 por inmunodetección o por western blot, queremos ahora utilizar estos anticuerpos para verificar si hay una interacción entre Cdc42l y Rac1 a nivel de la activación. De manera adicional se encontró que los embriones con pérdida de función de Cdc42l con el morfolino dirigido contra el codón de inicio tiene alterada la migración por epibolia, presentando un retraso en general de 2 a 3 horas en esta migración pero en particular en el linaje celular de las células de la capa profunda (CCP) que incluso van más atrasadas con respecto a las células de la capa envolvente (CEE). Las CCP, son las células que contribuyen a formar al embrión y la CCE forman un ectodermo que se pierde eventualmente. Este retraso se observa aproximadamente al 70% de epibolia, posteriormente los embriones más afectados comienzan a morir. Hemos utilizado un segundo morfolino (MO2) dirigido contra la región 5’ al ATG del ARNm de Cdc42l, el cual presenta similitudes en su efecto al MO1, como los efectos en la intercalación previo a la epibolia, aún cuando no hemos confirmado el efecto en el retraso en la epibolia, pero si hemos verificado que ambos morfolinos disminuyen la cantidad de proteína Cdc42 por ensayos de western blot. Los embriones inyectados con el morfolino 2 pueden avanzar más en el desarrollo hasta las 24 horas, después de las cuales muere la mayoría. Interesantemente estos embriones presentan defectos en el desarrollo general pero en particular carecen de la región cefálica, y la región caudal aunque tiene defectos en su desarrollo está presente. Esto es relevante por que al provocar únicamente la ganancia de función de Cdc42l por la inyección de su ARNm, que incrementa la síntesis de la proteína, los embriones inyectados llegan a las 24 horas del desarrollo pero buena parte de estos carecen de la región caudal pero presentan un desarrollo aparentemente normal de la región cefálica, por lo que la pérdida función y la ganancia de función de cdc42l parecen tener un efecto complementario, lo cual también es muy interesante ya que no ha sido previamente reportado. _x000D_ _x000D_ RAC1 EN EL CONTROL DE LA CONVERGENCIA Y EXTENSIÓN._x000D_ Rac1 en pez cebra presenta dos copias en su genoma a diferencia de otros vertebrados como el humano, en donde solo hay una copia. Estos genes se han denominado Rac1 y Rac1l. Rac1 es el gen más conservado tanto a nivel de secuencia primaria de ADN y de proteína como en su estructura genómica con respecto al humano. En cambio Rac1l esta codificado por un solo exón y diverge notablemente tanto a nivel de secuencia primaria del ADN como de la proteína. Ambos genes se expresan de manera ubicua durante el desarrollo embrionario de pez cebra. Para analizar el papel funcional de esta proteína, provocamos la pérdida de función inyectando morfolinos contra Rac1 (Rac1MO1) que inhiben la traducción de su RNAm específico. En los embriones inyectados con Rac1MO encontramos que la proteína baja su expresión de manera significativa comparado con los controles y a nivel morfológico se afecta la migración celular por convergencia y extensión. El análisis del proteoma de embriones inyectados con Rac1MO1 reveló una proteína que baja su expresión de manera significativa Anexina V (AnxaV), lo cual fue corroborado por inmunodetección y falta confirmarlo de manera alternativa por ensayos de western blot. Fue importante el observar que al inyectar un morfolino contra AnxaV encontramos que también se afecta la migración celular por convergencia y extensión, además de que se corroboró la disminución de la proteína al menos por inmunotinción. Estos hallazgos son muy importantes ya que no existen reportes en la literatura del efecto de la pérdida de función de AnxaV en el desarrollo embrionario así como tampoco se ha reportado que esta proteína actúe debajo de la cascada de Rac1 en el desarrollo en vertebrados, lo cual en si mismo es una contribución muy importante por su originalidad. Adicionalmente en el presente proyecto queremos ahondar en analizar a que nivel se está llevando a cabo la regulación de Rac1 sobre AnxaV; si es a nivel de la transcripción o bien a nivel de la proteína._x000D_ De manera adicional los hallazgos previos indican que los dos genes de Rac1 en pez cebra tampoco presentan redundancia funcional, como es el caso de las copias del gen de Cdc42 expuesto más arriba. Sin embargo no contamos con datos acerca de las posibles funciones que lleva a cabo Rac1l, por lo que sería muy interesante analizar los efectos que tiene la pérdida de función de Rac1l en el desarrollo. _x000D_ Los embriones con pérdida de función de Rac1 logran avanzar en su desarrollo hasta las 24 horas. En estos embriones fue interesante encontrar defectos en la formación de los miotomos y en la organización de las fibras musculares lo cual fue corroborado por medio de tinciones del citoesqueleto de actina. Este hallazgo es relevante ya que previamente se ha reportado que la migración celular que ocurre en la gastrulación permite a las diferentes capas germinales presentar contactos dinámicos los cuales participan