La foliculogénesis ovárica es un proceso especializado en el que están involucrados varios factores celulares y moleculares, que de manera coordinada, llevan a término el proceso de maduración, produciendo ovocitos susceptibles de ser fecundados (1). Entre los procesos más importantes que controlan este fenómeno se encuentran la comunicación intercelular a través de señales químicas y la promovida a través de uniones comunicantes (u.c.) (2,3). Es reconocido que el conocimiento sobre los diferentes procesos que ocurren en las células somáticas (c.s.), y de su comunicación con el ovocito, es fundamental en la comprensión de la ovogénesis y su control. De su estudio se generará conocimiento sobre procesos celulares básicos, no completamente entendidos, como la liberación de transmisores, el control del volumen celular, la especificidad de las señales, la apoptosis o el proceso de inflamación, así como información con repercusiones en los procesos de tumorogénesis._x000D_ En los últimos años, en el INb-UNAM hemos publicado hallazgos originales que demuestran la expresión funcional de un complejo sistema de comunicación purinérgica (CP) en el folículo ovárico de vertebrados, entre los que se incluyen: la demostración original de la expresión de receptores específicos, la liberación de ATP en el folículo de la rana, y los efectos de su estimulación en folículos de rana y mamífero, así como los primeros indicios de las posibles funciones en las que este sistema podría estar involucrado (e.g., 4-13). La CP está ampliamente difundida en diferentes tipos celulares, en donde está involucrada en una variedad de funciones (14), además, cada vez son mas las patologías asociadas con una alteración en su funcionamiento y los componentes moleculares son ahora señalados como potenciales blancos terapéuticos (14,15). Los estudios propuestos aquí incluyen aspectos fundamentales del funcionamiento a nivel molecular y celular de la CP, y también líneas enfocadas a comprender el papel de la CP en la foliculogénesis, tanto a nivel fisiológico como patológico. Así, en el aspecto molecular y celular de la CP, estudiaremos la participación de los múltiples subtipos de receptores expresados en las células foliculares (c.f.) en la generación de respuestas específicas del folículo, y sobre la transformación que estas respuestas sufren en dos preparaciones foliculares; ambos problemas son ejemplos de interrogantes de frontera para la comprensión de cómo la CP regula las funciones celulares (16). Estudiaremos también un aspecto que ha permanecido sin ser abordado y es fundamental para entender el papel y alcance de la CP en el ovario de mamífero, éste es la capacidad y mecanismos de las células del ovario para liberar ATP. En cuanto a las posibles repercusiones de la CP en el ovario, estudiaremos el acoplamiento entre las c.s. y el ovocito, especialmente con referencia a una posible permeabilidad selectiva de las u.c. que explicaría la especificidad de la señal transmitida por substancias purinérgicas desde las c.s. al ovocito (ver, 2,3). Finalmente, estudiaremos las propiedades biofísicas de los receptores P2X7 expresados, tanto en células normales del epitelio superficial ovárico (o.s.e.) como de células tumorales derivadas de este epitelio. La importancia de este receptor radica en que esta involucrado en la proliferación y muerte celulares, así como en procesos de inflamación (17), fenómenos muy activos en la fisiología del o.s.e. durante la ovulación.

LA CP EN EL OVARIO DE VERTEBRADOS; CONTRIBUCIONES PREVIAS. Los diferentes procesos que llevan a la producción de un gameto maduro, están regulados por una serie de mecanismos sistémicos e intraováricos que funcionan en concierto a través de múltiples vías de comunicación. Las dos principales vías, la comunicación química y eléctrica han mostrado ser fundamentales en el proceso de la gametogénesis, y en el caso del ovario, en la ovulación (1). El estudio del folículo de la rana Xenopus laevis, como modelo de comunicación celular a principios de los años 90´s, nos llevó al descubrimiento de varios tipos de receptores membranales sensibles a una gran variedad de transmisores en la membrana de las células foliculares (c.f.) en comunicación con el ovocito (e.g., 24,25). En ese momento su participación en la fisiología del folículo aun no era clara, y el conocimiento referente a la estructura molecular de los receptores se estaba generando en paralelo. La CP fue uno de los sistemas de comunicación mas conspicuos, y que provocaban respuestas de mayor complejidad en las células (4,5). Desde aquella fecha a la actualidad nuestro laboratorio a contribuido con las siguientes evidencias, entre otras: 1) Que las células somáticas (c.s.) en el folículo de vertebrados expresan una variedad amplia de receptores purinérgicos, tanto del tipo P1 como del tipo P2X y P2Y; 2) Que folículos de rana, y los complejos (CEO) formados por células del cumulus (c.c.) y ovocito en ratón, responden a substancias purinérgicas y que las respuestas tanto eléctricas como metabólicas, son transmitidas al ovocito a través de uniones comunicantes (u.c.); 3) Que el ovocito de Xenopus libera ATP de forma basal, y estimulada mecánicamente, y que este transmisor actúa de forma paracrina sobre los receptores en las c.f.; 4) Que los principales segundos mensajeros que participan en la CP en el folículo son el AMPc y el IP3/DG (Ca2+); 5) Que el folículo de Xenopus expresa un probable heterómero funcional formado por receptores A2 y P2Y acoplado a la síntesis de AMPc y sensible por igual a adenosina y a ATP; 6) Que las células de la teca y las células del epitelio superficial ovárico (o.s.e.) de mamíferos expresan de forma específica receptores del tipo P2X7, y que su activación provoca apoptosis, esta acción para el caso del o.s.e. al menos, es dependiente del ciclo estral; 7) Que la CP en c.s. del ovario activa respuestas eléctricas por la apertura de una diversidad de canales iónicos, algunos generan un aumento del Ca2+ intracelular, también promueve la proliferación celular, la muerte programada, y regula la esteroidogénesis, entre otros efectos. Evidencias que han permitido apoyar la idea original, de que la CP es un factor intraovárico que influye en los procesos fundamentales de la foliculogénesis y la ovulación._x000D_ PREGUNTAS FUNDAMENTALES, “ESTADO DEL ARTE”. En el estudio del papel de la CP en el ovario reconocemos dos vertientes que, por supuesto, se entrecruzan continuamente: 1) Los problemas fundamentales ligados al funcionamiento de la CP y sus elementos moleculares, y 2) Los problemas fundamentales que tienen que ver específicamente con la CP entre las c.s., y de éstas con el ovocito. Nuestros estudios han aportado conocimiento en los dos aspectos, en parte debido a las ventajas experimentales que presenta como modelo de comunicación intercelular la utilización del folículo de rana, cuyos hallazgos han sido corroborados y ampliados en folículos de mamífero por nuestro grupo. Existen en el campo de la CP preguntas esenciales que permanecen sin ser resueltas cabalmente, algunas de estas son por ejemplo: 1) El de la interacción entre diferentes receptores co-expresados en una célula, ¿Es común la heteromerización de los receptores tipo P1 y P2Y? ¿Cómo se lleva a cabo y cómo se regula?; 2) Cuáles son las determinantes estructurales de la compleja respuesta producida por la activación de los receptores P2X7, 3) ¿Es la activación del receptor P2X7 esencial en la regulación de la proliferación y muerte celulares?¿Su funcionamiento tiene entonces relación con los procesos de tumorogénesis?; 4) ¿Cómo se regula la liberación de ATP?¿Cuántos y cómo se determinan los mecanismos de liberación utilizados en un tipo celular?; 5) En un sistema co-expresando una colección de receptores purinérgicos y otros acoplados a las mismas vías intracelulares, ¿Cuáles son los elementos que determinan la especificidad de la señal?, ¿Cómo afecta la acción del sistema purinérgico a los demás sistemas de información expresados?._x000D_ Por igual, existen preguntas importantes derivadas de nuestros estudios que serán esenciales para definir el papel funcional de la CP en la fisiología ovárica. Algunas de las preguntas que abordaremos en este proyecto son planteadas a continuación._x000D_ CONTRIBUCIONES ESPERADAS DEL PROYECTO A REALIZAR. Las investigaciones propuestas tienen como interés general la de aportar conocimiento fundamental que permita comprender el papel funcional de la CP entre las células del ovario de vertebrados. En folículos de rana y ratón la estimulación de receptores específicos a ATP, localizados en las c.f. o las c.c., activan respuestas eléctricas complejas que son transmitidas a través de u.c. al ovocito. En rana, se pueden identificar tres principales respuestas, una corriente de K+ que depende de AMPc (IK), corrientes de Cl- activadas tanto por la liberación de Ca2+ (respuesta FCl) como por su influjo (Iiw), éstas son debidas a canales de Cl- expresados en las c.f., por último corrientes de Cl- que son sensibles a la osmolaridad (SCl). Sabemos que todas estas respuestas son estimuladas a través de receptores P2Y, sin embargo, su identidad molecular se desconoce. Experimentos realizados por nuestro grupo muestran que el perfil farmacológico de las respuestas no corresponde con ninguno de los receptores conocidos actualmente, de hecho con apoyo del PAPIIT, clonamos los principales receptores de Xenopus expresados en las c.f. y estudiamos su farmacología expresándolos en la membrana del ovocito, esto corroboró que sus características no cumplen con las del receptor nativo. Entre las razones de este comportamiento, es probable que la respuesta nativa no sea provocada por un solo tipo de receptor sino por la acción combinada o concertada de dos o mas subtipos, es también probable que esta acción conjunta dependa de interacciones heteroméricas. El caso mas claro es la activación de la respuesta IK por ATP, al ser también estimulada por adenosina, hemos propuesto que su activación se debe a la estimulación de un heterómero formado por receptores A2 y P2Y. Sin embargo, el problema de la identidad de los receptores foliculares también incluye al que estimula a los canales FCl (5,9), y a la respuesta SCl, ya que su característica secuencia farmacológica de 2MeS-ATP>UTP>ATP>>Bz-ATP tampoco corresponde a los receptores clonados hasta ahora. Para resolver este problema y contando con las secuencias de los P2Y clonadas de Xenopus, proponemos realizar estudios de silenciamiento utilizando RNA antisentido o de interferencia y evaluar su efecto sobre las respuestas nativas. Esta información también será útil para comprender la transición que sufre la respuesta a ATP en las preparaciones w.f. y e.t.r.; en este caso hemos mostrado que la respuesta a ATP cambia de IK en w.f. a la activación de FCl en folículos e.t.r., los posibles mecanismos involucrados en este fenómeno son múltiples, un estudio de silenciamiento específico de receptores ayudaría a delimitar los mecanismos en la transición. En este mismo contexto, realizaremos experimentos bloqueando o activando una de las dos vías principales, AMPc e IP3/DG, tanto en folículos w.f. como e.t.r. Los resultados que se obtengan proveerá herramientas de análisis acerca de los mecanismos involucrados en la transición. Otros objetivos del proyecto representan propuestas originales cuya información actual en el sistema ovárico es prácticamente inexistente, estas incluyen: 1) Permeabilidad diferencial de las uniones comunicantes entre c.f. o c.c. con el ovocito, en rana y ratón. También de nuestros datos recientes se desprende evidencia que indica que las c.f. s