La determinación sexual en los vertebrados ha evolucionado siguiendo múltiples modalidades. En términos generales puede agruparse en dos grandes grupos: determinación sexual genética (DSG) y determinación sexual ambiental (DSA). En las especies con DSA, el factor más estudiado es la temperatura en diversos reptiles incluyendo a las 7 especies de tortugas marinas. Una de ellas, Lepidochelys olivacea anida de manera abundante en las costas del sur de México siendo objeto de estudio en nuestro laboratorio durante varios años. Conocemos el periodo sensible a la temperatura (PST) durante el cual un creciente número de individuos determina su sexo en función de la temperatura de incubación. La temperatura de 33°C y 26°C promueven la eclosión de hembras (TF) y machos (TM), respectivamente. Correlacionando la estructura de la gónada con el PST, sabemos que corresponde a la etapa indiferenciada cuando se establecen redes moleculares que determinan la formación de un ovario o un testículo. En el actual proyecto proponemos ampliar el conocimiento de los genes involucrados y los mecanismos que median el efecto de la temperatura. Para lo cual, planeamos las siguientes estrategias experimentales:_x000D_ Estudiar el efecto del estradiol e inhibidores estrogénicos sobre embriones incubados a TF o TM para conocer los efectos de las hormonas esteroides durante el desarrollo de la gónada. En la literatura hay reportes de reversión sexual parcial o total de macho a hembra inducida por estradiol (E2) exógeno, lo que llevó a proponer que la temperatura modula los niveles endógenos de esa hormona durante el PST. Sin embargo, es posible que la reversión sexual experimental inducida por E2, se deba a la activación de mecanismos diferentes a los regulados por la temperatura. Para elucidar el problema compararemos los patrones de expresión génica en gónadas con E2 exógeno y las diferenciadas por efecto de la temperatura. _x000D_ Conociendo el importante papel que juega la regulación epigenética en el desarrollo, es sorprendente que no existan estudios en organismos con DST. Es razonable postular que el efecto de la temperatura es mediado por mecanismos epigenéticos que estabilizan las redes de expresión responsables de la formación de ovario o testículo. En el actual proyecto proponemos analizar los niveles de metilación global del ADN en gónadas incubadas a TF o TM. Así mismo, compararemos la metilación de promotores de SOX9, DMRT1 y FOXL2; genes involucrados en el determinación sexual de vertebrados. Planeamos también analizar las modificaciones postraduccionales de histonas en diferentes linajes celulares de la gónada, empleando técnicas de inmunofluorescencia confocal._x000D_ Finalmente, aprovechando el conocimiento adquirido en el laboratorio sobre la determinación y diferenciación sexual de L. olivacea, consideramos que es un buen modelo para estudiar los efectos biológicos de la contaminación en lechos marinos. Entre los agentes contaminantes más difundidos está el Bisfenol-A empleado en la elaboración de varios plásticos. Forma parte del grupo de disruptores endócrinos con efecto estrogénico por lo que es de interés estudiar su efecto sobre el desarrollo de los órganos reproductores de L. olivacea._x000D_

El actual proyecto está enmarcado en la línea de investigación del responsable sobre el desarrollo de la gónada en vertebrados. Empleando diversos modelos animales (anfibios, rata, ratón, conejo y tortuga marina), el grupo de trabajo ha investigado la migración de las células germinales primordiales (CGP) y la interacción entre células germinales y somáticas. Posterior al estudio descriptivo con microscopía de alta resolución, realizamos experimentos in vivo e in vitro aplicando hormonas o fármacos, estudiando el papel del mesonefros adyacente y en el ratón, analizando perturbaciones genéticas. Algunos de nuestros resultados han contribuido a una mejor comprensión de los procesos de determinación y diferenciación sexual de la gónada desde un punto de vista comparativo. _x000D_ Los estudios realizados por nuestro grupo en la tortuga marina Lepidochelys olivacea datan de más de 20 años. Al tratarse de una especie con determinación sexual por temperatura (DST), nos ha dado la oportunidad de analizar la expresión de genes involucrados en la determinación sexual, previos a la diferenciación morfológica (formación de ovario o testículo) en condiciones controladas. Es decir, podemos distinguir la regulación de la expresión de genes dimórficos antes, durante y después del periodo sensible a la temperatura (PST)._x000D_ Conocemos el patrón de expresión de varios genes entre los que destaca el SOX9, muy conservado en la gónada de vertebrados amniota. Un reciente hallazgo fue que en L. olivacea el SOX9 se expresa precozmente en el epitelio celómico cuyas células originan los cordones medulares y la corteza por divisiones asimétricas. De manera que el linaje medular mantiene la expresión de SOX9 en tanto que en la corteza, dicho gen se regula negativamente. La gónada bipotencial contiene las dos poblaciones de células y es sobre ellas que la temperatura ejerce su acción promoviendo el desarrollo de los cordones medulares o el epitelio cortical para diferenciar testículo u ovario, respectivamente (Díaz-Hernández et. al. 2012; Merchant-Larios and Díaz-Hernández, en prensa)._x000D_ Todavía se desconoce el mecanismo por medio del cual la temperatura promueve o facilita la determinación sexual durante el PST. Sin embargo, asumimos que en especies DST, algunos linajes celulares establecen redes de expresión génica alternativas, de manera similar a las especies con determinación sexual genética (DSG). La vulnerabilidad de las especies con DST para estabilizar la red masculinizante o feminizante, permite detectar diferencias en función de la temperatura que lleven a elucidar los mecanismos que regulan el proceso. _x000D_ Es posible que la regulación diferencial del SOX9 en la gónada de L. olivacea, refleje la estabilización de dos estados estructurales de la cromatina en los cordones medulares y la corteza. Dichos estados a su vez dependen entre otros factores, de los niveles de metilación/acetilación del ADN e histonas. En el presente proyecto nos proponemos analizar los niveles de metilación global del ADN y en los promotores de algunos genes relevantes en la determinación y diferenciación sexual de la gónada de L. olivacea. Al respecto, iniciamos una colaboración con el Dr. Félix Recillas a través de dos estudiantes (una de doctorado y uno de licenciatura), experto en epigénesis quien cuenta con los recursos metodológicos necesarios para hacer factible esta parte del proyecto. Se trata de una contribución original, considerando que hasta ahora no hay investigaciones sobre el papel que juegan los factores epigenéticos en la determinación sexual en especies con DST._x000D_ Por otra parte, el efecto feminizante del estradiol (E2) exógeno aplicado a embriones, ha llevado a postular que los niveles de esta hormona esteroide en la gónada, son responsables de la determinación sexual de la gónada en no mamíferos. En el caso de organismos con DST, la temperatura modularía la actividad de la enzima aromatasa y/o la transcripción del gen codificante (P450arom) estableciendo el contexto requerido para la diferenciación sexual de la gónada. A pesar de la atractiva simplicidad de esta hipótesis, tanto los patrones de expresión génica como el crecimiento de la gónada en embriones tratados con E2 difieren con los modulados por efecto de la temperatura. Nuestros estudios en L. olivacea muestran claramente que la aplicación de E2 o inhibidores de la aromatasa alteran de manera considerable el desarrollo, produciendo un efecto teratógeno sobre la gónada y los conductos reproductores. Estos resultados nos llevaron a considerar que L. olivacea representa un buen modelo para estudiar el efecto de agentes contaminantes que actúan como disruptores endócrinos con efecto estrogénico. _x000D_ La experiencia adquirida en nuestro laboratorio sobre el desarrollo de la gónada de la tortuga marina poniendo a punto diversas técnicas y métodos experimentales, nos colocan en posición de aplicar el conocimiento básico adquirido, para estudiar las graves consecuencias ecológicas de la contaminación ambiental. Es posible que los resultados de este primer esfuerzo, sirvan de base para el desarrollo de un grupo multidisciplinario interesado en los efectos reproductivos de agentes contaminantes en las diversas especies marinas. _x000D_