Los microRNAs (miRNAs) son moléculas de RNA de 20-24 nucleótidos, que actúan como factores reguladores de la expresión genética tanto en animales como en plantas (Axtell et al., 2011). El complejo multiproteico de silenciamiento inducido por RNA (RISC) utiliza a los miRNAs para reconocer por complementariedad de bases a un transcrito blanco e inhibir su expresión. Este mecanismo es utilizado por las plantas para regular distintos procesos del desarrollo y de respuesta a fitohormonas (Kidner and Martienssen, 2005). En respuesta a estrés por falta de agua, se ha identificado la inducción de miR159 por sequía o por ácido abscísico (ABA) durante la germinación (Reyes and Chua, 2007), mientras que miR169 se inhibe durante sequía en plantas adultas de A. thaliana (Li et al., 2008). Por otro lado, mediante el uso de estrategias globales como secuenciación masiva y microarreglos se han descrito miRNAs cuyos niveles cambian durante tratamientos de déficit hídrico y otros tipos de estrés en distintas especies (revisado en Covarrubias and Reyes, 2010). A pesar de estos avances, la identificación de los transcritos regulados por estos miRNAs se ha limitado en la mayoría de los casos a aquellos descritos en A. thaliana y su papel en condiciones de estrés no se ha explorado ampliamente. El papel de los miRNAs sólo puede ser entendido si conocemos los mensajeros que son regulados y en consecuencia los procesos celulares que se ven afectados. La identificación de dichos transcritos blanco es la parte medular de esta propuesta y el objetivo principal de nuestros estudios en un futuro próximo._x000D_ Utilizamos Phaseolus vulgaris como modelo para estudiar la función de los miRNAs en respuesta a diferentes estímulos ambientales por ser una planta de interés agronómico. A la fecha, hemos identificado nuevos miRNAs en frijol presentes en condiciones de estrés e iniciado la caracterización de varios de ellos (Arenas-Huertero et al., 2009) y más recientemente hemos continuado su identificación de forma global mediante el uso de estrategias de secuenciación masiva (tesis de licenciatura en Ciencias Genómicas de Minerva Trejo y resultados no publicados). Tomando este conocimiento como base, en el presente proyecto trataremos de extender nuestro entendimiento de la función de los miRNAs enfocándonos en la identificación de sus mRNAs blanco. Para ello tomaremos dos estrategias complementarias: por un lado continuaremos con el estudio de algunos miRNAs nuevos que se inducen por déficit hídrico: miR2118, miR2199, miR2199 y miR1514a, así como otros de reciente identificación por secuenciación masiva. Por otro lado seguiremos con un enfoque global para caracterizar la población de transcritos que son blanco de regulación por miRNAs. Para ello, utilizaremos la identificación por secuenciación masiva de transcritos que fueron cortados por la acción de miRNAs. Este análisis ya ha iniciado con resultados preliminares muy alentadores. Cabe mencionar que una de nuestras limitaciones es la falta de la secuencia completa del genoma de P. vulgaris, aunque avances recientes en otros grupos de trabajo indican que contaremos con esta información durante el desarrollo de este proyecto. La caracterización de nuevos miRNAs en frijol, junto con el análisis de los mensajeros regulados por los mismos, nos dará una idea de la relevancia biológica de este mecanismo de regulación para la respuesta a estrés, así como de la diversidad de procesos afectados por los miRNAs de plantas en general.

Además de caracterizar los miRNAs conservados de frijol, hemos encontrado algunas secuencias que representan miRNAs propios de frijol y otras leguminosas. Hasta el momento hemos identificado miRNAs nuevos propios de frijol y otras leguminosas como soya (Arenas-Huertero et al., 2009; Subramanian et al., 2008). Por lo anterior, hemos profundizado en su estudio con el objetivo de entender su participación en la regulación de los procesos celulares en frijol, en particular aquellos procesos relacionados con la respuesta a estrés hídrico, con lo que tenemos dos reportes en preparación (Contreras-Cubas et al., Sometido; De la Rosa et al., En preparación). _x000D_ Actualmente estamos explorando otras bibliotecas de RNAs pequeños provenientes de otras condiciones de crecimiento de frijol, como son hojas, flores, raíces y plántulas que hemos generado por secuenciación masiva (Unidad universitaria de Secuenciación Masiva de DNA, UUSMD, UNAM) y que estamos analizando junto con el grupo del Dr. Federico Sánchez (IBT,UNAM), (Pelaez et al., En preparación). Pensamos que cada una de estas bibliotecas puede mostrarnos distintos aspectos del control de la expresión genética en frijol frente a distintos estímulos ambientales. De las bibliotecas que obtuvimos inicialmente y, como describimos más arriba, hemos identificado miRNAs propios de leguminosas. Estamos convencidos de que podemos seguir identificando nuevos RNAs pequeños reguladores si analizamos las condiciones que se han mencionado y este conocimiento nos ayudará a tener un mejor entendimiento del repertorio de respuestas a nivel molecular adoptadas por frijol para contender con distintos estímulos ambientales. Incluso proponemos que el análisis sistemático de los RNAs pequeños identificados por secuenciación masiva nos llevarán a reconocer la participación de otros RNAs tales como tasiRNAs y siRNAs involucrados en la regulación post-trascripcional y epigenética, respectivamente, que podrían representar elementos regulatorios en condiciones de estrés. Puesto que hemos encontrado que los miRNAs de frijol están presentes también en otras leguminosas como soya o Medicago truncatula, nuestros resultados podrán ser extrapolados a entender las estrategias de adaptación al medio ambiente en estas otras plantas de interés agronómico._x000D_ Sin embargo, nuestros avances se han visto limitados al no poder identificar eficientemente los blancos de regulación por miRNAs. Un fenómeno similar se observa en la literatura más reciente, donde se describen miRNAs y su acumulación en distintas condiciones de crecimiento pero no sus mensajeros blanco (Covarrubias and Reyes, 2010). Es por esta razón que hemos tomado distintas estrategias para responder esta pregunta, incluyendo predicciones bioinformáticas y la identificación de aquellos RNAs asociados a AGO1 de frijol, donde hemos encontrado microRNAs y tenemos evidencia de algunos mRNAs que son blancos conocidos de miRNAs._x000D_ De forma alternativa, hemos implementado una metodología que esta dirigida a identificar de una muestra de RNA aquellos mRNAs que han sido cortados. Estos fragmentos, dentro de los cuales se encuentran fragmentos generados por el procesamiento dirigido por miRNAs, son posteriormente preparados para someterse a un protocolo de secuenciación masiva (Illumina, en la UUSMD, UNAM), conocido coloquialmente como “Degradoma”. Esta metodología la llevamos a cabo en colaboración con el Dr. Ramanjulu Sunkar (Dept. of Biochemistry & Molecular Biology, Oklahoma State University) quien la ha utilizado exitosamente en arroz (Li et al., 2010). El análisis bioinformático de las secuencias obtenidas ya lo iniciamos y contamos con algunos resultados preeliminares muy alentadores. Adicionalmente, esta estrategia es complementaria a nuestras predicciones bioinformáticas anteriores, pues ofrece una comprobación independiente. El presente proyecto tiene como uno de sus objetivos principales utilizar la información derivada de este tipo de experimentos para ayudarnos a identificar nuevos blancos de regulación por miRNAs y asi poder deteminar el impacto que esta via de regulación tiene durante la respuesta de frijol ante condiciones de déficit hídrico. _x000D_