La investigación de los mecanismos del desarrollo en general, y del desarrollo de plantas en particular, es actualmente una de las áreas de la biología más importantes. En plantas, la raíz es un modelo útil para estudios del desarrollo, porque tiene una estructura relativamente simple y está compuesta por pocos tejidos y un número menor de funciones si se compara con la complejidad de la parte aérea de la planta. La raíz primaria en la mayoría de las especies presenta crecimiento indeterminado debido a que el meristemo se mantiene activo y permite a la raíz crecer por tiempos muy largos. En algunas cactáceas del Desierto de Sonora la raíz primaria tiene crecimiento determinado, es decir, las células del meristemo apical de la raíz pasan solamente por unos pocos ciclos celulares y después se diferencian (Dubrovsky, 1997 a, b, Dubrovsky y Gómez-Lomelí, 2003). Hasta la fecha se desconocen la regulación genética del crecimiento determinado de la raíz y el agotamiento del meristemo en estas especies. Como parte del proyecto anterior IN212509 llevamos a cabo el “mRNA-seq” de dos muestras de puntas de la raíz primaria del cardón P. pringlei. La primera muestra proviene de la etapa inicial del desarrollo de la raíz primaria, cuando hay meristemo; y la segunda, de la etapa terminal, cuando el meristemo se ha agotado. Obtuvimos más de 20 millones de secuencias de 85 bases de largo y las ensamblamos de novo en 31, 224 contigs (o transcritos). Asignamos funciones probables a las proteínas - productos de los transcritos ensamblados - y estimamos in silico la expresión diferencial de genes en las etapas inicial y final. El objetivo de esta propuesta es estudiar la regulación genética del mantenimiento y agotamiento del meristemo apical de la raíz primaria de las cactáceas del Desierto de Sonora. Para esto nos basaremos en los resultados del proyecto en curso y utilizaremos como herramienta el análisis de genes de P. pringlei cuyos homólogos en la planta modelo Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) participan en el mantenimiento del meristemo apical de la raíz. Además, seguiremos con el establecimiento de un sistema de transformación in vitro, mediada por Agrobacterium tumefaciens de especies con crecimiento determinado de la raíz y regeneración de las raíces transgénicas a partir de callos transformados para el futuro análisis del papel de los genes identificados como importantes para la progamación genética del crecimiento determinado. Este trabajo representará uno de los primeros estudios amplios a nivel molecular del desarrollo en cactáceas, debido a que hasta el día de hoy prácticamente no existe información sobre genes de cactáceas implicados en los procesos del desarrollo.

El proyecto propuesto contribuirá en el entendimiento de la regulación genética de los procesos del desarrollo relacionados con la adaptación de las plantas a los ambientes áridos y a la sequía. La biología del desarrollo de plantas desérticas es un área infraexplorada de la investigación y es importante para entender mejor las estrategias adaptativas de las plantas de zonas áridas. _x000D_ _x000D_ Para comprender los mecanismos generales del desarrollo de raíces en plantas y las bases moleculares de la diversidad en sus estrategias de crecimiento, es necesario conocer y comparar los aspectos moleculares del desarrollo de especies diferentes. La mayor parte de las investigaciones del desarrollo de la raíz a nivel molecular se han realizado en la especie modelo Arabidopsis thaliana. Durante los últimos años, estos estudios se han ido ampliando para abarcar otras especies vegetales con importancia económica, tales como plantas leguminosas o las especies monocotiledoneas arroz y maíz, las últimas tienen sistemas radicales con características diferentes de los de especies dicotiledóneas. Gracias al desarrollo reciente de las metodologías de secuenciación de nueva generación, se ha agilizado el avance en la exploración de los mecanismos moleculares y las redes genéticas que participan en el desarrollo en diferentes especies vegetales, ya que esta tecnología permite no solamente obtener una gran cantidad de datos, sino para el caso de “RNA-seq” comparar niveles de expresión de los transcritos en diferentes muestras biológicas. _x000D_ _x000D_ Las cactáceas constituyen un grupo muy especializado y bien adaptado para las condiciones del desierto. El crecimiento determinado de la raíz primaria y el agotamiento del meristemo en las cactáceas que se estudiarán en este proyecto, representa un sistema único, que permite analizar los mecanismos de mantenimiento y agotamiento del meristemo apical en plantas de tipo silvestre que no tienen lesiones en el genoma, y se encuentran en condiciones óptimas de crecimiento. Aunque existen mutantes de A. thaliana que muestran características de crecimiento determinado de la raíz primaria y de agotamiento del meristemo, estas mutantes, además, tienen ciertas anormalidades en el desarrollo, porque poseen mutaciones de pérdida de función de genes involucrados en el mantenimiento del RAM. Las mutaciones de ganancia de función de los genes reguladores también pueden provocar cambios fuertes en la expresión de varios genes de distintas vías, lo que puede dificultar explicación de participación de cada una de ellas en el mantenimiento. El crecimiento determinado de la raíz primaria de las plantas no mutantes de A. thaliana se reportó solamente en dos condiciones: (1) la severa deprivación de fósforo (Sánchez-Calderón et al., 2005), la condición que afecta drásticamente el metabolismo y el bienestar general de las plantas y (2) o en medio suplementado con 50 um o 1 mM de L-glutamato, condición que es muy diferente de las condiciones ambientales del cultivo de especies vegetales (Walch-Liu et al., 2006). Por lo anterior, el análisis de las plantas de cactáceas crecidas a partir de semillas colectadas en la naturaleza, ofrece claras ventajas para la caracterización de de la regulación genética del mantenimiento y agotamiento del RAM y del crecimiento determinado de la raíz primaria. _x000D_ _x000D_ Hasta un tiempo muy reciente, el obstáculo fuerte para realizar investigaciones a nivel molecular en las cactáceas fue la falta de información sobre las secuencias de genes de este importante grupo de plantas. La mayoría de las secuencias de nucleótidos de cactáceas que se encuentran depositadas en la base de datos de NCBI “GenBank” son secuencias usadas con fines de sistemática molecular o, en pocas ocasiones, de detección de secuencias polimórficas SSPL (microsatélites) como marcadores moleculares. En los últimos años está emergiendo la posibilidad de evadir el obstáculo mencionado, porque el avance muy rápido en el desarrollo de nuevas tecnologías de secuenciación y programas de computación permiten obtener secuencias nucleotídicas por medio de ensamblaje de novo, por lo que tener la secuencia genómica dejó de ser un requerimiento fuerte para estudios a nivel molecular de las especies no modelo. Durante el proyecto PAPIIT IN212509 en curso, gracias al cambio en la metodología para poder utilizar estas técnicas recientes de RNA-seq y el ensamblaje de novo de las lecturas cortas resultantes, obtuvimos y anotamos las secuencias de más de 31000 contigs que se expresan durante el desarrollo de la raíz primaria de P. pringlei. Hasta ahora no se ha publicado ningún trabajo comparable que utilice cactáceas e incluso prácticamente no existe información sobre los genes de cactáceas implicados en procesos de desarrollo: las pocas publicaciones que existen describen, por ejemplo, el aislamiento del gen P5CS de Opuntia streptocarpa, que está involucrado en la biosíntesis de prolina, y análisis funcional durante el estrés salino de un gen de Opuntia (Silva-Ortega et al., 2008). Otra publicación trata de la caracterización de la expresión del gen de tuna (Opuntia sp.) que codifica para una poligalacturonasa, enzima implicada en la maturación del fruto de muchas especies vegetales (Rosas-Cárdenas et al., 2007). [Los dos trabajos mencionados se llevaron a cabo en México.] _x000D_ _x000D_ En conclusión, la información obtenida en el proyecto en curso permitirá llevar a cabo tanto la caracterización general del transcriptoma de una especie cactácea, como el estudio de la expresión diferencial y de regulación genética de desarrollo de la raíz, los que representarán un avance importante en nuestro entendimiento de los mecanismos de desarrollo de las cactáceas desérticas y su adaptación al medio ambiente árido. _x000D_