Independientemente de la función particular que ejerza una proteína, su mecanismo de acción involucra un evento de interacción de tipo no covalente con otra molécula, ya sea con otra proteína o con algún otro tipo de biomolécula. Una de las áreas de frontera de mayor auge en la Biología Molecular moderna trata de comprender el fundamento estructural y energético del reconocimiento molecular por parte de las proteínas, como una ruta racional hacia su manipulación utilitaria. Elucidar las bases moleculares de la formación de un complejo proteico implica entender los principios sobre los que se construyen dos propiedades centrales del reconocimiento molecular: la especificidad y la afinidad. La especificidad se refiere a la capacidad que tiene una proteína de discriminar entre ligandos semejantes, y se sustenta en el grado de complementariedad estereoquímica de las superficies interactuantes. La afinidad involucra la forma en la cual las fuerzas moleculares se combinan para hacer al reconocimiento un proceso espontáneo. La creciente disponibilidad de datos estructurales de alta resolución ha permitido describir con detalle atómico las diversas estrategias para lograr la especificidad en un sinnúmero de complejos proteicos. Sin embargo, si bien la especificidad y la afinidad son propiedades interrelacionadas, hasta el momento no ha sido posible deducir una propiedad de la otra: la experiencia ha mostrado de manera incontrovertible que la dilucidación de las bases moleculares de la espontaneidad requiere de un conocimiento muy detallado de la energética involucrada, lo cual implica conocer a profundidad la termodinámica del proceso. En los últimos años, la calorimetría de titulación isotérmica (CTI) ha llegado a ser una herramienta fundamental en la aplicación de la química física al estudio de procesos de reconocimiento biomolecular. Esta técnica permite determinar con una precisión sin par los parámetros termodinámicos de interacción entre un receptor y su ligando a temperatura constante. En el caso de complejos proteicos, la proteína es considerada típicamente como el receptor, en tanto que el ligando puede ser otra proteína, o moléculas de tipo no proteico como carbohidratos, ácidos nucleicos, moléculas hidrofóbicas o iones. A presión constante, el calor medido equivale al cambio de entalpía, y dado que es proporcional al número de moles de complejo formados, es posible a su vez determinar la constante de equilibrio a través de la aplicación de un protocolo convencional de titulación. Así, la CTI permite medir en un solo experimento el cambio de energía libre, de entalpía y de entropía, así como la estequiometría de la reacción. Con el reciente advenimiento de calorímetros de alta sensibilidad, el uso de CTI ha crecido exponencialmente, por lo que, como ha sido reconocido ampliamente, esta técnica ha entrado en una época dorada. Nuestro grupo de investigación ha estado enfocado en mejorar nuestra comprensión sobre las bases energético-estructurales de la formación de diversos tipos de complejos de proteína. Dado que la solución del problema de los determinantes de la estabilidad de sistemas proteicos precisa de establecer vínculos cuantitativos entre la energética y la estructura de los sistemas en estudio, los estudios han contemplado una vertiente experimental tendiente a la caracterización mediante CTI de la energética de formación de diferentes complejos cuya estructura tridimensional ha sido determinada previamente. Esta información bipartita ha sido usada para desarrollar y calibrar modelos que permiten predecir la estabilidad de un complejo a partir del análisis de su estructura tridimensional in silico. Usando como plataforma este marco cuantitativo, recientemente hemos iniciado una vertiente adicional, enmarcada en la ingeniería de proteínas, en el cual se persigue la modificación racional de la especificidad de proteínas. En el estado actual del arte no es posible modelar las múltiples interacciones que se crean en un complejo de proteína. Este grado de complejidad no permite obtener una solución general y, por tanto, el progreso en esta área se basa en el análisis de modelos particulares. Por otro lado, diferentes estudios, incluyendo algunos generados en nuestro grupo, han mostrado que las estrategias energético-estructurales entre diferentes tipos de complejos de proteína pueden diferir sustancialmente, por lo que se precisa de la generación de marcos energético-estructurales específicos para cada tipo de complejo. Por tanto, en este proyecto se plantea la caracterización termodinámica de complejos proteína-proteína, proteína-carbohidrato, proteína-nucleótido y proteína-lípido. Se estima que además de comprender con mejor detalle las bases moleculares para cada tipo de complejo, el análisis comparativo entre diferentes tipos permita arrojar luz adicional sobre el proceso global del reconocimiento proteico. Adicionalmente, este conocimiento será utilizado para el diseño y generación de proteínas reconocedoras de carbohidratos capaces de reconocer ligandos sacarídicos diferentes a los silvestres. El apoyo aquí solicitado nace de los requerimientos necesarios para dar viabilidad financiera a nuestra línea de investigación durante los tres años próximos venideros. Además de cubrir con los gastos básicos que involucra este tipo de proyecto, se persigue seguir fortaleciendo y actualizando las facilidades de nuestro laboratorio, de manera que pueda consolidarse como el principal centro de calorimetría de proteínas del país y quizá de toda Latinoamérica. En particular, se espera poder terminar el montaje y puesta a punto del recientemente formado laboratorio de Biología Molecular en el Departamento de Bioquímica del Instituto de Química. La facilidad de generar proteínas recombinantes impactará en una mayor disponibilidad de receptores proteicos a estudiar, y la posibilidad de generar mutantes tanto para responder aspectos puntuales del comportamiento energético-estructural observado como para la producción de enzimas con actividad modificada. El desarrollo de este proyecto involucra la participación de cinco alumnos de doctorado y dos de licenciatura. Además, se seguirá fortaleciendo la colaboración con tres laboratorios: 1) el del Dr. Sergio de Jesús Aguilar Romero, del Departamento de Bioquímica de la Univesidad Autónoma de Querétaro, quien es especialista en la producción de proteínas recombinantes en Aspergillus niger, sistema eucariote pertinente para la producción de proteínas que serán estudiadas en este proyecto; 2)el del Dr. D. Alejandro Fernández Velasco, del Departamento de Bioquímica de la Facultad de Medicina de la UNAM, quien se especializa en la caracterización espectroscópica de cambios conformacionales en proteínas; y 3) el del Dr. Miguel Costas Basín, de la Facultad de Química de la UNAM, experto en termodinámica de procesos al equilibrio. Adicionalmente, se proponen actividades puntuales que permitan difundir el uso de la Biocalorimetría en México, como lo es la realización de cursos intensivos impartidos por especialistas de renombre mundial, así como la organización de reuniones científicas en nuestro país.

El presente proyecto está concebido para contribuir en tres planos diferentes dentro del campo del reconocimiento proteico. (1) Por un lado, se pretende ahondar en nuestro conocimiento sobre los principios moleculares que gobiernan la formación de complejos de proteína. La caracterización calorimétrica de las propiedades energéticas de formación de diferentes tipos de complejos de proteína, así como el establecer vínculos cualitativos y cuantitativos con propiedades estructurales, permitirá una mejor comprensión de las estrategias energético-estructurales particulares a cada tipo de complejo. En este contexto, se espera poder resolver para los modelos de estudio propiedades termodinámicas más sutiles de medir, información que servirá para seguir refinando los modelos energético-estructurales que hemos venido desarrollando en nuestro laboratorio. (2) Teniendo este marco cuantitativo como referencia, proponemos la modificación racional de la especificidad en el reconocimiento de ciertos modelos proteicos. En una primera etapa nos centraremos en el cambio de la actividad de proteína reconocedoras de carbohidratos, por ser este tipo de sistemas con el cual más experiencia contamos en el grupo de investigación. (3) En otro plano, se plantea que este proyecto contribuya a consolidar y fortalecer la calorimetría de proteínas en nuestro país. Si bien se han dado pasos significativos en este sentido (un indicador tangible de la labor realizada, por ejemplo, es el hecho de que el responsable de este proyecto fue invitado como ponente plenario a la Reunión Europea sobre Aplicaciones de BioCalorimetría que tuvo lugar Alemania en Julio del año en curso), aún existe un amplio espacio para expandir el uso de esta técnica en nuestro país.