Síntesis del Proyecto_x000D_ El neuroblastoma (NB) es un tumor infantil del sistema nervioso simpático (SNS). Se origina a partir de las células de la cresta neural denominadas neuroblastos. El tratamiento en la mayoría de los casos, incluye dos cirugías y quimioterapia (Rostion CG. 2007). Entre los fármacos utilizados para el tratamiento del NB, se encuentran agentes alquilantes como el cisplatino (Gajardo C, et al., 2007), que presentan una gran variedad de efectos secundarios._x000D_ _x000D_ Las Casiopeínas® (Cas) son una serie de complejos quelados mixtos de cobre II, desarrollados y patentados a nombre de la UNAM y que han mostrado tener actividad antitumoral. El mecanismo exacto de la actividad antineoplásica de estos compuestos, aún no ha sido dilucidado; sin embargo, se ha relacionado con daño en la mitocondria y un decremento considerable en los niveles intracelulares de GSH._x000D_ Dos de estos compuestos, Cas IIgly y IIIia, inducen apoptosis en líneas celulares de cáncer de pulmón (Kachadourian R, et al., 2010), y meduloblastoma (Mejia C, et al., 2008). Los fibroblastos y linfocitos sanos han mostrado menor sensibilidad a Cas IIgly en comparación con las células tumorales. En adición, en modelos in vitro, Cas IIgly ha mostrado una actividad 10 a 100 veces mayor y un mejor índice terapéutico que el cisplatino (Leal-García M, et al., 2007). Por su parte, Cas IIIia inhibe la proliferación en las líneas de cáncer de cerviz, con mayor potencia que el cisplatino (Gracia-Mora I, et al., 2001). _x000D_ _x000D_ El mecanismo de acción de las Casiopeínas es motivo de intensa investigación. Se ha sugerido que su efecto antiproliferativo se explica por la inducción de apoptosis en líneas celulares tumorales. La apoptosis activada por factores intracelulares es dependiente de la liberación de citocromo C desde la mitocondria, seguido por la activación de caspasas (Green DR & Kroemer G. 1998) y endonucleasas (Kroemer G, et al., 1997; Sakahira H, et al., 1998) causando la fragmentación del DNA y la consecuente muerte celular. Al igual que el citocromo C, el factor inductor de apoptosis (AIF), también puede ser liberado desde la mitocondria induciendo así un proceso de apoptosis independiente de caspasas (Alberts B, et al., 2002). En el núcleo, AIF junto con una segunda proteína mitocondrial, Endo G, induce condensación de la cromatina y fragmentación del DNA a gran escala (Cande C, et al., 2002). La permeabilidad de la membrana mitocondrial a estos componentes, depende en muchos casos de la formación y actividad del canal activado por apoptosis (MAC), localizado en la membrana exterior de este organelo. Aunque su completa identidad molecular es desconocida, se sabe que Bax y Bak (ambos miembros de la familia Bcl-2), son componentes putativos de este canal (Kinnally KW, et al., 2007). La actividad y expresión de Bax y Bak puede verse disminuida en diversos tipos tumorales resultando en resistencia a los agentes desencadenantes de la apoptosis, entre los que se encuentran algunos antineoplásicos como el cisplatino (McConkey DJ, et al., 1996; Wang GQ, et al., 2001; Rashmi R, et al., 2005). Por lo tanto, identificar las moléculas que están involucradas en el mecanismo de acción de estos compuestos antitumorales es de capital importancia. _x000D_ _x000D_ Este trabajo pretende confirmar que es la vía intrínseca o independiente de caspasas, la que se favorecida durante la apoptosis en el neuroblastoma por efecto de las Casiopeínas IIgly y IIIia. Debido a que durante este proceso se ve alterada la mitocondria con la consecuente liberación de moléculas como las especies reactivas de oxígeno, queremos tener evidencia de esta actividad. Y finalmente, pretendemos tener un acercamiento hacia la naturaleza de los canales o poros mitocondriales a través de la expresión de las moléculas apoptóticas Bax y Bak._x000D_ _x000D_ Los Objetivos Específicos que se plantean en este trabajo son:_x000D_ 1. Determinar la vía apoptótica que las Casiopeínas IIgly y IIIia inducen en dos líneas celulares de neuroblastoma._x000D_ _x000D_ 2. Identificar la expresión de las especies reactivas de oxígeno y las enzimas del estrés oxidativo, generadas por el tratamiento con Casiopeínas._x000D_ _x000D_ 3. Analizar la naturaleza de los canales en la membrana mitocondrial externa durante la apoptosis por Casiopeínas IIgly y IIIi, y establecer la función de Bax y Bak en dicho fenómeno._x000D_ _x000D_ _x000D_ La metodología propuesta para abordar los diferentes objetivos, es la siguiente:_x000D_ - Cultivo Celular y Concentración Inhibitoria media_x000D_ - Determinación de Apoptosis_x000D_ - Fraccionamiento subcelular_x000D_ - Análisis por Western blot_x000D_ - Medición de la formación de Especies Reactivas de Oxígeno_x000D_ - Detección de superóxido mitocondrial_x000D_ - Detección de Apoptosis por Glutatión_x000D_ - Ensayo de la peroxidación de lípidos_x000D_ - Acción de la N-acetil-L-cisteína en la muerte celular_x000D_ - Ensayo del potencial de membrana mitocondrial_x000D_ - Aislamiento de mitocondrias_x000D_ - Detección inmunocitoquímica de Bax y Bak_x000D_ - Determinación de la activación de Bax y Bak Expresión de Bax y Bak y su incidencia en el efecto apoptótico_x000D_ _x000D_

CONTRIBUCION DEL PROYECTO_x000D_ Con este trabajo pretendemos ahondar en el conocimiento del fenómeno apoptótico por efecto del tratamiento con los compuestos de cobre (II), denominados Casiopeínas. Debido a que la evidencia apunta a que la vía apoptótica intrínseca es la que se ve favorecida, es deseable conocer qué moléculas están involucradas en este proceso. También pretendemos averiguar la relación que las especies reactivas de oxígeno tienen con las moléculas apoptóticas, durante este proceso. Otro objetivo que pretendemos abordar con este proyecto, es un acercamiento a la naturaleza de los poros o canales mitocondriales por efecto de las Casiopeínas, con la finalidad de poder establecer su uso como posibles dianas terapéuticas. Consideramos que al final de nuestra investigación, se contribuirá al conocimiento de los mecanismos de acción de estos compuestos, con lo cual esperamos presentar a las Casiopeínas IIgly y IIIia como potenciales fármacos para el tratamiento del neuroblastoma. _x000D_ _x000D_ _x000D_