Las proteínas que participan en mantener la homeostasis de calcio en la célula muscular y en particular en el retículo sarcoplásmico (RS) de músculo esquelético y cardiaco, son de mucha importancia para la función contráctil normal y su alteración en expresión y función resultan en varias patologías. Las bombas de calcio del retículo sarco(endo)plásmico (SERCAs) tienen como función controlar los niveles de las concentraciones de calcio libre en el citosol ([Ca2+]c) de los miocitos. Las SERCAs son responsables de mantener la velocidad de contracción y relajación de músculo cardiaco y esquelético. Además, las bombas SERCA tienen un papel crucial en varios mecanismos de señalización intracelular. Sin embargo, aún se desconocen varios de los mecanismos moleculares responsables de su expresión, tanto a nivel transcripcional como epigenético. Un número creciente de estudios han demostrado que la recaptura de calcio dentro del RS es la causa subyacente de la patogénesis de la disfunción, hipertrofia y de la insuficiencia cardiaca. La bomba SERCA2a juega un papel esencial en el secuestro de calcio dentro del RS; la disminución en su expresión y actividad de transporte de la puede llevar directamente a la disfunción cardiaca, por lo que es importante explorar los mecanismos moleculares que regulan su expresión y actividad en el corazón normal y patológico. Recientemente se ha demostrado que la eliminación de una de las dos copias del gen SERCA2 (Atp2a2) en ratones resulta en una alteración de la homeostasis de calcio dentro de cardiomiocito y de su función contráctil._x000D_ _x000D_ La calsecuestrina cardiaca (CASQ2) es una proteína acídica que tiene afinidad moderada de unión por calcio (1 mM) con gran capacidad (50 mol de Ca2+/mol de proteína) y que se es la mas abundante dentro del interior del RS de corazón, principalmente en la porción de la cisterna terminal del RS y que participa de forma importante en la captura, almacenaje y liberación de calcio de este organelo. En modelos animales de hipertrofia cardiaca se ha demostrado que la actividad de unión al ADN de los factores de transcripción Sp1 y Egr1 se encuentran elevadas para algunos genes que codifican para proteínas que controlan la homeostasis de calcio en cardiomiocitos. En particular se ha demostrado que Egr1 funciona como un represor transcripcional del gen Casq2. La transcripción del gen Casq2 se puede modificar por agentes que modifican el nivel de acetilación de proteínas y por 5-azacitidina que es un agente hipometilante del ADN, lo que sugiere que mecanismos epigenéticos pueden modular la expresión de este gen. En este proyecto proponemos analizar que regiones del promotor del gen humano de Casq2 son responsables de cambios en la expresión de esta proteína por mecanismos epigenéticos que modulan su transcripción. _x000D_ _x000D_ La sarcalumenina (SAR) en es una proteína que se expresa en el RS longitudinal con propiedades de unión de calcio similares de unión de calcio a la calsecuestrina y se sugiere que interacciona con SERCA2a y participa manteniendo la función cardiaca en respuesta al estrés. En cardiomiocitos de corazones hipertróficos se ha examinado el papel de SAR en mantener la función cardiaca. Los resultados de los estudios usando un modelo de ratón knock out (SAR-KO) demuestran que SAR interacciona funcionalmente con SERCA2a incrementando la estabilidad esta última y facilitando el transporte de Ca2+ dentro del RS. También se ha demostrado recientemente que la SAR es esencial para mantener de forma adecuada la función cardiaca durante el ejercicio de resistencia en ratones. _x000D_ _x000D_ En este proyecto proponemos estudiar los mecanismos epigenéticos que modulan la expresión de los genes SERCA2, Casq2 y SAR en líneas celulares de músculo esquelético C2C12 y Sol 8, en la línea celular H9C2 que se puede inducir a diferenciar en fenotipo cardiaco, y en cultivos primarios de cardiocitos de ratas neonatas. Se cuantificarán los niveles de ARNm por RT-PCR de tiempo real, y por Western blot los niveles de proteína. Se analizará la participación de los elementos de unión a factores de transcripción que participan en la transcripción de los genes SERCA2 y Casq2 en líneas celulares musculares y en cardiomiocitos. Se estudiará el papel del nivel de metilación del ADN en la isla CpG presente en la región reguladora del gen SERCA2. Se usará 5-azacitidina para hipometilar al ADN y se analizarán cambios en los niveles de expresión de ARNm y proteína. También se evaluará el grado de metilación de la región reguladora del los genes SERCA2, Casq2 y SAR por una técnica de modificación química de citosinas usando bisulfito y PCR tiempo real para observar cambios en la Tm de los productos de ADN. Además, usando inhibidores de histonas desacetilasas (HDACs) tipo I, II y III se evaluará su participación en la expresión de estos genes en los diferentes tipos celulares. _x000D_ _x000D_ Otro de los objetivos de este proyecto es estudiar el nivel de expresión de ARN y proteína para SERCA2, CASQ2 y SAR en los corazones de los ratones haploinsuficientes para el gen SERCA2 (Atp2a2+/-). También se analizará el nivel de metilación de la región 5´-reguladora de estos genes. Este modelo murino heterocigoto Atp2a2+/- resulta particularmente útil para estudiar el papel que juega la expresión disminuida de SERCA2 en la patogénesis de la disfunción y de la hipertrofia cardiaca. En este modelo animal se estudiarán los efectos del inhibidor de HDACs tipo III, resveratrol, en la disfunción cardiaca y en la expresión de SERCA2, CASQ2 y SAR. Por todo lo anteriormente mencionado, los resultados de este proyecto contribuirán al conocimiento de la participación de mecanismos epigenéticos que regulan la transcripción de proteínas clave en la homeostasis de calcio de los miocitos.

Las enfermedades cardiovasculares son la causa más importante de muerte representando cerca del 30% de las muertes a nivel mundial. La insuficiencia cardiaca es el resultado final de cualquier condición que lleva a la alteración de la estructura y/o función del ventrículo izquierdo. A nivel celular existen múltiples alteraciones entre las que se encuentran cambios en la síntesis proteíca, reexpresión de genes fetales (p ej, ANF), cambios en la expresión de isoformas de miosina de cadena pesada y actina (MHC-α en lugar de MHC-β, α-actina esquelética en lugar de actina cardiaca), alteraciones en la expresión de proteínas responsables del manejo del Ca2+(expresión reducida de SERCA2a), alteraciones en el metabolismo energético, etc. _x000D_ _x000D_ A pesar de los avances recientes de la investigación de músculo y corazón, aún se desconocen con precisión cuales son los mecanismos moleculares responsables que regulan la expresión de genes que participan en la homeostasis de calcio intracelular. En este proyecto proponemos estudiar la contribución de mecanismos epigenéticos como son la acetilación de histonas y otras proteínas, y la metilación de los promotores en la expresión de tres proteínas clave en la regulación de la [Ca2+]i, SERCA2, CASQ2 y SAR, y por tanto indicativo de la función contráctil del cardiomiocito. _x000D_ _x000D_ Previamente en nuestro laboratorio hemos clonado la región reguladora-5´ del gen SERCA2 humano (Atp2A2) y generado varias construcciones en pGL3-basic (Brady et al., 2003; Zarain-Herzberg and Alvarez-Fernandez, 2002; Zarain-Herzberg et al., 1990). La región proximal del gen SERCA2 tiene 4 sitios de unión para factores Sp, una TATA-box consenso y un elemento de respuesta a stress del RE. Hemos estudiado el papel del [Ca2+]i en la transcripción del gen en cardiomiocitos en cultivo. El tratamiento de cardiomiocitos en cultivo con Tg, A23187 y rianodina durante 12h, aumenta la actividad transcripcional del gen SERCA2 (2 a 3 veces). En contraste, EGTA y BAPTA reducen la actividad transcripcional del gen SERCA2 en 50% y en 80%, respectivamente. La adición de 5 mM de Ca2+ al medio de cultivo aumenta 1.5 veces la transcripción del gen SERCA2. Para corroborar si el aumento en la transcripción del gen SERCA2 es debido al aumento transitorio en la [Ca2+]i se reguló a la baja la expresión endógena de SERCA2, mediante inhibición de la traducción del ARNm para SERCA2 usado un vector adenoviral que codifica un ARNi para SERCA2, por medio de infección de cardiomiocitos en cultivo. Después de 72 h de la infección se observó una disminución de 90% en cantidad del ARNm de SERCA2, mientras que la actividad transcripcional de las construcciones del promotor del gen SERCA2 aumentó entre 2 y 3 veces. Estos resultados sugieren que variaciones en la [Ca2+]i modulan por un mecanismo de retroalimentación la transcripción del gen SERCA2, para lograr un control fino del transporte de Ca2+ en el cardiomiocito (manuscrito en preparación). _x000D_ _x000D_ Resultados preliminares en nuestro laboratorio de ensayos funcionales de construcciones en pGL3 que contienen el promotor del gen SERCA2 humano transfectados transitoriamente en cardiomiciotos de ratas neonatas en cultivo, revelan que el butirato (un inhibidor de HDACs y activador de fosfatasas de serina/treonina) incrementa la transcripción del gen SERCA2 y SERCA3 varias veces. Resultados similares se observaron en la expresión del ARNm endógeno para SERCA2b y para SERCA3 (resultados no publicados). En este proyecto proponemos continuar el estudio del efecto de varios inhibidores de HDACs sobre la transcripción de los genes SERCA2 Casq2 y SAR en células musculares esqueléticas y cardiacas (resultados no publicados)._x000D_ _x000D_ Las regiones distales del promotor del gen Casq2 contienen sitios de unión a factores de transcripción que regulan de forma positiva la transcripción del gen en músculo cardiaco y la reprimen en músculo esquelético (Reyes-Juarez et al., 2007). El objetivo de este proyecto es caracterizar los mecanismos moleculares por medio de los cuales dichos factores de transcripción regulan la expresión del gen Casq2 en cardiomiocitos y en músculo esquelético. _x000D_ Sin embargo, pese a todas las alteraciones descritas en la expresión de distintos genes cardiacos durante la insuficiencia cardiaca, la expresión de CASQ2 parece permanecer inalterada, por lo tanto resulta importante dilucidar de manera precisa los mecanismos moleculares que regulan la expresión de dicho gen, ya que dicha característica junto con su especificidad tisular convierten a su promotor en un candidato ideal para utilizarlo a través de vectores virales en terapia génica dirigida al tratamiento de patologías cardiacas. Además, este proyecto contribuirá a entender el papel de HDACs y metilación del ADN en la expresión de la CASQ2._x000D_ _x000D_ El uso del ratón haploinsuficiente de SERCA2 (Atp2a2+/-), nos permitirá caracterizar en detalle la participación de la expresión disminuida de SERCA2a en el corazón, y como estos cambios en [Ca2+]i inducen a su vez cambios en la expresión de otros genes, específicamente CASQ2 y SAR. Además se elucidará la contribución de mecanismos epigenéticos en la expresión de la expresión de SERCA2, CASQ2 y SAR, y de saber si la inhibición de HDACs tipo III por el compuesto resveratrol afecta la expresión de estas proteínas.