En el área de la biología del desarrollo de plantas cada día es más importante la información que se obtiene del análisis de los genomas para entender los procesos moleculares que dirigen el desarrollo de las plantas. Este objetivo se cubre en gran medida mediante el estudio de la función de cada gen de las plantas. En el caso del estudio del desarrollo de la raíz que se lleva a cabo en nuestro laboratorio, la atención de esta propuesta se encuentra dirigida particularmente al análisis del papel de tres genes involucrados en el desarrollo de la raíz en la planta modelo Arabidopsis thaliana. En los proyectos anteriores apoyados por DGAPA encontramos alteraciones muy interesantes en el desarrollo de la raíz primaria de las plantas mutantes que incluyen a mko1 (Hernández-Barrera et al., 2011) y otras, tentativamente llamadas “dg” (determinate growth) y “sl” (“short lateral root”). En éstas la raíz primaria es muy corta y las raíces laterales muestran morfogénesis anormal y se desarrollan en menor número que en las plantas del tipo silvestre. Con base en los severos defectos de las raíces de estas plantas hemos generado la hipótesis de que los genes alterados en estas mutantes son importantespara el desarrollo de la raíz, particularmente para la iniciación y morfogénesis de los primordios de las raíces laterales (PRL), así como para el mantenimiento de actividad del meristemo apical de la raíz (RAM, “root apical meristem”) primaria. Una característica común de estas mutantes es que la morfogénesis de los PRL y la actividad de RAM están alteradas, lo cual resulta muy atractivo para nosotros debido a que el problema de la regulación de la morfogénesis del PRL y de mantenimiento del RAM son campos que, pese a su importancia, se encuentran estudiados de manera incompleta. Es por ello que estas tres mutantes son apropiadas para estudiar la morfogénesis de la raíz lateral. Planeamos identificar los genes MKO1, DG, y SL de Arabidopsis thaliana y establecer su papel en el desarrollo de la raíz. La identificación por medio de secuenciación masiva de poblaciones de mapeo de los genes afectados, la clonación de los genes mutados y el análisis del patrón de expresión de ellos nos permitirán investigar la función de estos genes en el desarrollo de la raíz. Para lograr este último objetivo también continuaremos el análisis a nivel celular muy detallado del desarrollo de la raíz de las plantas mutantes y particularmente, la morfogénesis de los PRLs, de la identidad de sus tejidos, de la proliferación y elongación celular en ellos y sus respuestas a las hormonas que afectan el desarrollo de la raíz de manera significativa. También analizaremos el patrón de expresión de los marcadores de diferentes tipos celulares en el fondo genético de las mutantes. Además, para la mutante dg analizaremos cómo el reestablecimiento de la función normal del gen DG en diferentes compartimientos tisulares alrededor de las células del centro quiescente (QC) y en ellas (en el fondo genético de dg) afecta el reestablecimineto normal de mantenimiento de RAM y el crecimiento de la raíz. Planeamos realizar esto último mediante el sistema de transactivación GAL4-UAS. Como producto tangible de este proyecto publicaremos los resultados de esta investigación en tres revistas internacionales con arbitraje, preparemos una tesis de licenciatura, dos de maestría y una de doctorado.

Pese a que existe información sobre las bases genéticas de funcionamiento del RAM de Arabidopsis thaliana (Bennett and Scheres, 2010; Sablowsky, 2011), están predichas componentes adicionales de las vías génicas de regulación conocidas (Azpeitia et al., 2010). También no podemos excluir que existen algunas vías aun desconocidas de la regulación de actividad de células troncales involucradas en el mantenimiento del RAM. Nosotros hace varios años iniciamos el tamizaje, aislamiento y caracterización de mutantes que nos pueden ayudar en la tarea de identificar estos componentes desconocidos o nuevas vías de regulación de funcionamiento del RAM. Los tres genes bajo estudio pueden potencialmente representar estos componentes desconocidos o ser parte de vías nuevas de control de organización y/o actividad del RAM. Nuestros datos indican que estos genes también son esenciales para el desarrollo de las raíces laterales (RLs)._x000D_ _x000D_ Las mutantes mko1 (Hernández-Barrera et al., 2011), dg y sl aisladas en nuestro laboratorio representan fenotipos muy interesantes y no descritos anteriormente, por ello consideramos que la caracterización completa de las mutantes a nivel celular e identificación de los genes afectados nos permitirán conocer nuevos factores importantes para el desarrollo de la raíz. Estas mutantes tienen en común defectos es el desarrollo del RAM y capacidad limitada de crecimiento, así como en la morfogénesis anormal de primordios de la RL (PRL). Por lo tanto, estas mutantes son apropiados para el análisis del desarrollo del RAM y de PRL, que son temas estudiados en el área de la Biología del Desarrollo Vegetal de manera incompeta (Malamy and Benfey, 1997; Hirota et al., 2007; Peret et al., 2009). Para evaluar si las plantas mutantes tienen afectada la identidad de los diferentes tejidos, las plantas mutantes se cruzarán con las líneas de Arabidopsis que expresan marcadores moleculares específicos para diferentes tipos celulares de la raíz._x000D_ _x000D_ En Arabidopsis thaliana se han identificado diversas vías de regulación importantes para el mantenimiento del RAM. La vía SHORT ROOT - SCARECROW (SHR - SCR) regula tanto el mantenimiento como el patrón de la organización del RAM (DiLaurenzio et al., 1996; Helariutta et al., 2000; Sabatini et al., 1999). En las mutantes mko1 y dg, el RAM se agota por completo de manera similar a las mutantes shr y scr. Sin embargo, nuestro análisis demostró que por lo menos mko1 no tiene defectos en actividad de promotor de SCR (Hernández-Barrera et al., 2011). Los datos para otras mutantes bajo estudio serán obtenidos durante el proyecto propuesto. Ha sido demostrado que WUSHEL RELATED HOMEOBOX 5 (WOX5) es esencial para identidad y mantenimiento del centro quiescente (QC, Sarkar et al., 2007). El QC representa un grupo de células que mantienen actividad de organizador del RAM y se considera como el nicho de células troncales (Sabatini et al., 1999, 2003). Otra vía esencial en la especificación y mantenimiento del nicho de células troncales en el RAM está comprendida por los factores de transcripción de la familia AP2/EREBP: PLETHORA1, PLETHORA2, PLETHORA3 y BABY BOOM (PLT1, PLT2, PLT3, BBM, Aida et al., 2004; Galinha et al., 2007). Los genes PLT controlan tanto la proliferación como la elongación celular de manera dosis-dependiente (Aida et al., 2004; Galinha et al., 2007). La doble mutante plt1 plt2 presenta crecimiento determinado de la raíz (Aida et al., 2004). En este proyecto investigaremos cómo PLT1 y PLT2 se expresan en fondo genético de las mutantes mko1, dg, y sl. Este análisis nos dará información sobre posibles interacciones entre los genes de interés y los genes PLT1 y PLT2. Es probable que por lo menos algunos genes bajo estudio (MKO1, DG o SL) representen una vía de regulación del RAM independiente de los genes PLT. La investigación planeada nos permitirá responder claramente a esta pregunta. La transcripción de los genes PLT se induce por la auxina (Aida et al., 2004) y estos genes son requeridos para promover la expresión de la familia de genes que codifican para transportadores de eflujo de la auxina PIN y estabilizar la máxima respuesta de auxinas en la parte distal del ápice de la raíz (Aida et al., 2004). Por lo tanto, en este proyecto planeamos analizar el comportamiento de los transportadores mencionados en el fondo genético de las mutantes bajo estudio._x000D_ _x000D_ Otra vía importante para la regulación del mantenimiento de las células troncales en el RAM es la vía de CLE CLV/ESR-RELATED40 (CLE40) - ARABIDOPSIS CRINKLY4 (ACR4) -WOX 5 (Terpstra and Heidstra, 2009; Veit, 2006; Stahl et al., 2009). El incremento de la expresión de CLE40 altera drásticamente el sitio de expresión de WOX5 y promueve la diferenciación de las células iniciales (Stahl et al., 2009). Nosotros ya demostramos que en fondo genético de mko1, la identidad de células de QC no cambia ya que actividad de promotor de WOX5 se mantiene. Al identificar el gen MKO1 será más claro, si interactúa o no con la vía CLE40-ACR4-WOX5. La misma información será analizada para los genes DG y SL. _x000D_ _x000D_ Existen genes que están interactuando con las diferentes vías de regulación. Por ejemplo, MERISTEM DEFECTIVE (MDF) que codifica una proteína con un dominio putativo RS, regula la expresión de los genes PLT1, PLT2, SCR y WOX5 (Casson et al., 2009). MDF es requerido para la organización y el mantenimiento del RAM ya que la mutante mdf pierde la capacidad de mantener el RAM debido a que el funcionamiento de células troncales está severamente afectado. El análisis de la expresión de MDF::GFP:MDF en fondo genético de las mutantes mko1, dg, y sl permitirá encontrar si existe o no interacción entre MDF y los genes de interés._x000D_ _x000D_ Considerando que en las mutantes bajo estudio el proceso de desarrollo de las RLs está severamente afectado, los genes respectivos deben tener un papel importante para desarrollo del sistema radical en plantas de tipo silvestre. El conocimiento sobre los genes que participan en el desarrollo de la raíz lateral es limitado. Por ejemplo, han sido descritas 22 mutantes con número de raíces laterales reducido y 14 mutantes con número más alto (De Smet et al., 2006). Sin embargo, no tenemos información sobre si la morfogénesis del PRL en estas mutantes se encuentra afectada. Una investigación de los cambios del transcriptoma durante la iniciación de la raíz lateral de Arabidopsis demostró que 906 genes se expresan diferencialmente (Himanen et al., 2004). Aunque esto no significa que todos estos genes estén involucrados directamente en el desarrollo de PRL, aparentemente, el papel de la mayoría de los genes importantes en el desarrollo de las raíces laterales no se conoce. El estudio propuesto nos ayudará conocer el papel de genes bajo estudio en el desarrollo de la raíz y particularmente, de la raíz lateral._x000D_ _x000D_ Además, los procesos del crecimiento de la raíz primaria y de la iniciación y morfogénesis de las raíces laterales están afectados en estas mutantes. Qué papel tienen los genes mko1, dg y sl en estos procesos es una pregunta principal de esta propuesta. Como mencionamos en la sección de Antecedentes, actualmente se conocen pocos genes indispensables para la iniciación de las raíces laterales: ALF4 (Celenza et al., 1995; DiDonato et al., 2004), SLR1 (Fukaki et al., 2002), ARF7, ARF19 (Okushima et al. 2005; Wilmoth et al. 2005) y LIN1 (Malamy and Ryan, 2001) son algunos de ellos. Las mutantes que planeamos continuar analizando en esta propuesta aparentemente tienen muy pocos eventos de iniciación de la raíz lateral y, por lo tanto, los genes afectados probablemente están involucrados también en este proceso. Datos recientes demuestran que el conocimiento solamente sobre el número de las raíces laterales formadas en plantas mutantes así como sobre la densidad de las raíces laterales no es suficiente para concluir sobre cómo está afectado el proceso de la iniciación de los PRLs. Por lo tanto, recientemente propusimos un nuevo e informativo parámetro, el índice de la iniciación de las raíces laterales, que nos permite determinar cuántas raíces se forman a lo largo de la porción de la raíz que abarca 100 células cortical