La Reacción Acrosomal (RA) es un evento exocitótico que se lleva a cabo en el espermatozoide de muchas especies y es un requisito para la fecundación. Este evento se induce por una proteína externa del óvulo conocida como ZP3 y depende de la movilización de Ca2+ en los espermatozoides, a través de canales tanto intracelulares como de membrana plasmática. A la fecha se ha descrito la presencia y participación durante la fecundación, de diversos canales de Ca2+ en espermatozoides de mamífero entre los que destacan los canales de Ca2+ dependientes de voltaje (CCVD), el receptor de IP3 y los canales operados por el vaciamiento de pozas internas (canales SOC) codificados, al menos en parte por la familia de receptores de potencial transitorio (TRP). En el espermatozoide de ratón recientemente se cuestionó la establecida participación de los CCVD durante el inicio de la RA. En humano sigue sin ser clara la identidad molecular de los CCVD que participan directamente en este proceso. La dificultad de obtener ZP3 de origen humano ha dificultado la caracterización de la RA en esta especie y gran parte de las investigaciones se han realizado con inductores alternativos como la progesterona. Sin embargo, es probable que la vía de señalización intracelular de la progesterona no sea la misma que la de la ZP3. En este proyecto proponemos producir en nuestro laboratorio ZP3 recombinante humana (con probada actividad biológica), la cual nos servirá para estudiar la movilización de Ca2+ inducida por esta proteína, caracterizar farmacológicamente a los canales involucrados así como seguir la cascada de señalización rio arriba y abajo de la entrada de Ca2+ en estas células. Tenemos datos preliminares que nos indican la participación de CCVD en la RA inducida por ZP3r (producida, purificada y donada por la Dra. Mayel Chirinos). Proponemos concluir el estudio de la participación de CCVD en espermatozoides de humano usando tanto inhibidores para las familias que no hemos explorado, como ZP3 recombinante producida ya en nuestro laboratorio. Posteriormente, proponemos caracterizar la entrada de Ca2+ inducida por la ZP3r con alta resolución temporal y espacial utilizando colorantes fluorescentes sensibles a Ca2+ y llevando a cabo mediciones en un espectroflurómetro de mezclado rápido y experimentos de imágenes en célula única. Con respecto a los canales tipo SOC, recientemente se descubrieron dos familias de proteínas (STIM y ORAI) que son componentes moleculares de la entrada de Ca2+ tipo SOC. Proponemos investigar la presencia de estas dos familias (5 genes en total) tanto en espermatozoides de ratón como de humano. Para este propósito, utilizaremos técnicas de biología molecular, western-blot e inmunocitoquímica. Además investigaremos la interacción entre las mismas o con miembros de la familia TRP mediante ensayos de inmunoprecipitación.

La fecundación es un proceso esencial para la preservación de todas las especies de reproducción sexual, y a pesar de que se conocen los conceptos generales de la fecundación, el entendimiento de los mecanismos bioquímicos que subyacen a este proceso es limitado. Es más, los paradigmas y modelos establecidos para las funciones básicas del espermatozoide (motilidad, capacitación y reacción acrosomal) han sido cuestionados por diversos grupos, dadas evidencias experimentales recientes. En particular, la identidad de los canales de Ca2+ que participan en la fisiología del espermatozoide sigue sin establecerse. Pretendemos utilizar nuevas metodologías, instrumentación y herramientas moleculares que nos permitan re-explorar la participación de distintos canales de Ca2+ en las funciones del espermatozoide, y así, contribuir a entender el funcionamiento de esta célula y proponer modelos congruentes con las evidencias experimentales. De manera específica, este proyecto tiene como propósito central estudiar, identificar y caracterizar a los canales de Ca2+ que inician la cascada de señalización que se activa cuando la glicoproteína ZP3 del óvulo de humano se une con su(s) receptor(es) en el espermatozoide culminando con la RA. Así mismo, pretendemos iniciar la disección de la cascada de señalización rio arriba y abajo de la apertura de los canales de Ca2+ inducida por ZP3. Como parte de los objetivos de este proyecto, purificaremos ZP3 recombinante mediante el sistema de expresión heteróloga en células Sf9 de insecto (la clona de ZP3 recombinante humana es una donación de la Dra. Mayel Chirinos del Instituto de Nutrición). Lograr la producción de ZP3 recombinante humana en nuestro laboratorio es muy importante pues nos permitirá estudiar el proceso de fecundación con un enfoque fisiológico más cercano, dado que la falta de esta proteína, ha sido una de las limitantes principales para comprender este proceso en la especie humana. Además es una herramienta que quedará en el laboratorio y nos permitirá seguir caracterizando la RA más allá de los objetivos de este proyecto. Es importante mencionar que ahora contamos con la instrumentación necesaria que nos permitirá resolver la movilización de Ca2+ y su farmacología en el espermatozoide de humano con alta resolución espacial y temporal inducida por el agonista fisiológico. Proponemos también investigar la presencia de dos familias de proteínas de reciente descubrimiento, las cuales forman parte del complejo molecular que da origen a la entrada de Ca2+ tipo SOC, en este caso usaremos tanto el modelo de ratón como el de humano pues no se El conocimiento obtenido contribuirá a que entendamos mejor cómo el espermatozoide fecunda al óvulo. Los hallazgos del proyecto podrían revelar principios básicos sobre las entidades moleculares involucradas en la fisiología del espermatozoide y contribuir a desarrollar novedosas formas de controlar la fecundación y explicar algunas disfunciones del espermatozoide del orden molecular que causan infertilidad. La ejecución de este proyecto producirá al menos dos tesis de maestría y una de licenciatura. Además los resultados obtenidos serán material para al menos tres publicaciones internacionales con arbitraje. Tenemos contemplado asistir a un congreso nacional y uno internacional por año, lo que daría un total de 6 presentaciones en congresos.