Síntesis del proyecto Los parásitos protozoarios del género Leishmania pertenecen a la familia Trypanosomatidae, junto con otros parásitos como Trypanosoma. Son varias las especies de Leishmania que infectan al hombre, produciendo enfermedades colectivamente conocidas como leishmaniasis, cuyas manifestaciones clínicas van de asintomáticas a letales. En México, la leishmaniasis cutánea es considerada un problema de salud pública, pues se ha reportado en al menos 22 estados. El genoma de los tripanosomátidos presenta una característica muy particular: los genes se encuentran organizados en grupos grandes de genes localizados en una misma cadena de DNA (unidades policistrónicas). También es inusual el hecho de que estos organismos presentan transcripción policistrónica y trans-splicing, y que aparentemente presentan muy pocas regiones promotoras. Poco se sabe en tripanosomátidos sobre la transcripción de Pol III, la cual sintetiza varios tipos de moléculas de RNA pequeñas que juegan papeles críticos en el metabolismo celular, como RNAs de transferencia (RNAt), RNAr 5S y algunos RNAs pequeños nucleares (snRNA). A la fecha no ha sido caracterizado ningún promotor tipo Pol III en Leishmania. En Trypanosoma brucei han sido parcialmente caracterizados algunos promotores de snRNAs. Estos genes presentan un gen de RNAt en su región flanqueante 5’, en la cadena opuesta. Resulta interesante que las cajas A y B del gen de RNAt contiguo son esenciales para la expresión del snRNA. En Saccharomyces cerevisiae la RNA Pol III consta de diecisiete subunidades. Además de la Pol III, varios factores de transcripción están involucrados en inicio, elongación y término de la transcripción. Éstos incluyen TFIIIA, TFIIIB, TFIIIC, SNAPc y el antígeno La. En Leishmania hemos identificado los genes de la mayoría de las subunidades de Pol III, pero muy pocas subunidades de factores de transcripción han sido localizadas. El número reducido de promotores y la aparente ausencia de muchos de los factores de transcripción en los tripanosomátidos sugieren que la epigenética podría jugar un papel importante en la regulación de la expresión génica en estos organismos. En levadura y eucariontes superiores se sabe que la estructura de la cromatina regula la expresión de los genes. La cromatina existe al menos en formas distintas: una forma condensada relacionada al silenciamiento de la transcripción (heterocromatina) y una forma relajada asociada a la transcripción activa (eucromatina). Diversas modificaciones en las histonas, como la acetilación y la metilación, juegan un papel muy importante en la expresión de un gen. A la fecha se sabe muy poco sobre estructura de la cromatina y regulación epigenética en tripanosomátidos; sin embargo, se presume que este tipo de regulación es importante en estos organismos, dada la presencia en sus genomas de genes de enzimas involucradas en la modificación de histonas, como acetil-transferasas y metil-transferasas. El objetivo principal de este proyecto es el de estudiar diversos aspectos de la transcripción de Pol III en L. major. Nuestro interés está principalmente dirigido hacia el estudio de la estructura de la cromatina en las regiones promotoras de Pol III, así como al análisis in vivo de las interacciones entre probables factores de transcripción e histonas modificadas con dichas regiones promotoras. Los objetivos específicos son: [1] identificar los promotores de los genes de los snRNAs U2 y U4 en L. major. El sitio de inicio de la transcripción de los dos genes será mapeado mediante ensayos de 5’-RACE. Se llevarán a cabo deleciones y mutaciones en los genes, y por medio de ensayos de transfección transitoria y “primer extension” identificaremos las secuencias importantes para la actividad promotora. [2] Analizar si los promotores de Pol III y sus regiones flanqueantes están organizados en nucleosomas. Para ello, cromatina será aislada, digerida con nucleasa micrococal y analizada mediante Southern blots con sondas específicas para cada promotor. [3] Analizar in vivo la presencia de histonas modificadas en los genes transcritos por Pol III; esto por medio de ensayos de inmunoprecipitación de la cromatina (CHIP), empleando anticuerpos contra histonas acetiladas y metiladas. [4] Estudiar in vivo la unión de probables factores de transcripción con los promotores de Pol III; para esto también se realizarían ensayos CHIP con anticuerpos contra BRF1 (subunidad de TFIIIB), SNAP50 (subunidad de SNAPc) y el antígeno La.

Los tripanosomátidos constituyen un grupo de protozoarios parásitos de importancia médica, pues producen enfermedades que tienen un gran impacto en la salud de millones de personas en áreas tropicales y subtropicales del mundo. Además, directa o indirectamente tienen un impacto económico cuantioso, al considerar todos los aspectos monetarios relacionados con la enfermedad y muerte que producen en humanos y también en ganado. Además de la importancia médica y económica, los tripanosomátidos son importantes desde el punto de vista molecular, pues presentan mecanismos de expresión genética muy diferentes a los presentes en otros organismos eucariontes. Entre éstos se incluye la transcripción policistrónica, el trans-splicing y la edición de los transcritos mitocondriales. Poco se sabe en estos parásitos sobre la transcripción de Pol III, la cual sintetiza varios tipos de moléculas de RNA pequeñas esenciales que juegan papeles críticos en el metabolismo celular. También se sabe muy poco sobre la estructura de la cromatina y su importancia en la expresión génica. El objetivo de este trabajo es determinar la organización nucleosomal de la cromatina de genes transcritos por la RNA polimerasa III de L. major. Asimismo, analizar in vivo las interacciones entre los promotores y probables factores de transcripción e histonas modificadas. Nuestra hipótesis es que la arquitectura de la cromatina va a jugar un papel muy importante en la expresión de los genes de Pol III. El presente proyecto constituye un primer esfuerzo por entender la importancia de los mecanismos epigenéticos en la expresión de Pol III en tripanosomátidos. Se espera que los resultados que se obtengan constituyan un avance significativo en esta importante área del conocimiento.