Dos organismos modelo serán utilizados en este proyecto: (i) el alga verde Chlamydomonas reinhardtii, cuyos genomas mitocondrial, cloroplastídico y nuclear se han secuenciado en su totalidad y que es un sistema con el cual se pueden realizar estudios de genética mitocondrial. (ii) el alga incolora Polytomella sp., un pariente cercano de Chlamydomonas con el cual se pueden aislar fácilmente mitocondrias intactas y llevar a cabo experimentos bioquímicos de los complejos participantes en la fosforilación oxidativa. Este proyecto está encaminado a entender la biogénesis, la función y la regulación de los complejos mitocondriales, en particular, la estructura y función del complejo V o ATP sintasa. En trabajos anteriores, caracterizamos varios complejos mitocondriales de estas algas. Encontramos que la ATP sintasa mitocondrial es un complejo dimérico estable, con una masa molecular de alrededor de 1,600,000 Da. Estudios del genoma del alga verde Chlamydomonas y estudios bioquímicos, nos llevaron a concluir que las regiones rotatorias y catalíticas de la enzima se encuentran conservada en estos organismos. Así, el complejo de la ATP sintasa de algas contiene a las subunidades catalíticas alfa y beta, a los constituyentes del brazo central gamma, delta y épsilon, a los componentes membranales clásicos (a la subunidad "a" y al oligómero de subunidades "c"), así como a la proteína OSCP (proteína que confiere sensibilidad al inhibidor OSCP). Sin embargo, la enzima carece de los otros componentes clásicos de la mayoría de las ATP sintasas mitocondriales (subunidades b, d, g, h, F6, A6L y IF1) y en su lugar, contiene 9 polipéptidos, que no se habían caracterizado previamente, y que denominamos ASA1 hasta ASA9 (ASA por las siglas del inglés de ATP Synthase Associated). Propusimos que estas subunidades forman el brazo periférico de la enzima y también, que alguna(s) de ella(s) podría(n) estar involucradas en estabilizar a la enzima dimérica. Utilizando diferentes estrategias experimentales, hemos caracterizado ulteriormente a la enzima, proponiendo un modelo de la cercanía topológica de las diferentes subunidades y modelos estructurales basados en estudios de SAXS (dispersión de rayos X de ángulo pequeño) y de microscopía electrónica. Por otra parte, caracterizamos funcionalmente a la enzima, encontrando que la actividad de hidrólisis de ATP se incrementa más de 200 veces en presencia de detergentes no iónicos. En el presente proyecto, deseamos seguir caracterizando a la ATP sintasa mitocondrial de las algas clorofíceas, con el fin de generar un modelo más detallado de cómo interaccionan las subunidades ASA entre sí, y conocer más de sus características cinéticas. Llevaremos a cabo estudios con las subunidades recombinantes purificadas después de expresarlas en sistemas bacterianos o de levadura. Estudiaremos la interacción entre las diversas subunidades ASA y con las subunidades ortodoxas de la ATP sintasa (en particular, con OSCP). También deseamos estudiar algunos aspectos de la biogénesis del complejo. Esta ATP sintasa, a diferencia de todas las ATP sintasas mitocondriales en otros eucariontes, se encuentra codificada en su totalidad en el genoma nuclear. En general, en la gran mayoría de los genomas mitocondriales, se encuentran presentes al menos tres genes que codifican para subunidades de la ATP sintasa, los genes atp6, atp8 y atp9. En contraste, en las algas clorofíceas ninguno de los genes que codifican para subunidades de la ATP sintasa se encuentra en el genoma mitocondrial. Esto indica que todas las subunidades que constituyen a las ATP sintasas de las algas clorofíceas son sintetizadas en ribosomas citosólicos e importadas al interior de la mitocondria. Estudiaremos la biogénesis de algunas de las proteínas que conforman a la ATP sintasa de las algas clorofíceas, con el fin de conocer más acerca de su procesamiento y del mecanismo de importación de las mismas. Finalmente, utilizando técnicas de RNA de interferencia, generaremos mutantes deficientes en la expresión de algunas de las subunidades ASA en Chlamydomonas reinhardtii, con el fin de conocer como la ausencia de éstas subunidades afecta la estructura y función de la ATP sintasa.

Nuestro trabajo previo ha contribuido a conocer parcialmente la estructura y función de una ATP sintasa mitocondrial novedosa, que presenta características estructurales atípicas, y que parece ser exclusiva de un linaje de algas clorofíceas cercanas al alga Chlamydomonas. Hemos descrito la presencia de 9 subunidades atípicas en dicha enzima y las hemos denominado ASA1 a ASA9. Demostramos que estas subunidades forman parte del brazo periférico del complejo, y que contribuyen a que la enzima sea un dímero altamente estable. Hemos secuenciado la mayoría de los genes (cDNAs) que codifican para estas subunidades en Polytomella, y montado un método para obtener a la enzima pura y funcional. El presente proyecto le da continuidad al proyecto anterior que fue apoyado por el PAPIIT. Consideramos que el conocimiento que se generará es relevante por dos motivos. Por una parte, resulta interesante describir con mayor detalle la estructura atípica de la ATP sintasa mitocondrial de las algas clorofíceas, que difiere fuertemente en composición y estructura de la gran mayoría de ATP sintasas mitocondriales de eucariontes. Es de gran interés para nosotros tratar de entender esta nueva estructura y conocer cómo es que, desde un punto de vista evolutivo, surgió una enzima con características estructurales tan distintas del resto de la ATP sintasas de otros organismos eucariontes. Por otra parte, se trata de un complejo enzimático que, a diferencia de otras ATP sintasas, todos sus componentes están codificados en el genoma nuclear. Por lo tanto, se trata de un complejo de la fosforilación oxidativa que se sintetiza totalmente en el citosol, y que sus 17 subunidades son importadas y ensambladas en el interior de la mitocondria. Esto tiene potencialidad para desarrollar a largo plazo, terapias génicas para intentar paliar enfermedades humanas relacionadas con mutaciones en los genes mitocondriales de las ATP sintasas.